Có th th c hi n nhi u phể ự ệ ề ương pháp nh nhu m acid nhanh c i ti nư ộ ả ế theo phương pháp Zielh Neelsen, phương pháp PCR, RT – PCR, ELISA…[58].
a. Xét nghi m phânệ
Phương pháp phù n i Fulleborn [ổ 1]
gi a noãn nang c a c u trùng v i dung d ch đữ ủ ầ ớ ị ường saccharose bão hòa. Vì t tr ng c a dung d ch đỷ ọ ủ ị ường bão hòa l n h n t tr ng noãn nang c a ớ ơ ỷ ọ ủ
Cryptosporidium spp., nên làm cho noãn nang Cryptosporidium spp. n i lên ổ b m t dung d ch.ề ặ ị
Cách ti n hành phế ương pháp phù n i Fulleborn nh sau:ổ ư
Cho vào c c th y tinh s ch 5 gam phân, thêm kho ng 50 - 60 ml dungố ủ ạ ả d ch đị ường saccharose bão hòa, dùng đũa th y tinh nghi n nh và khu y ủ ề ỏ ấ đ u cho tan phân. Ti p theo, lo i b c n bã b ng cách l c dung d ch phân ề ế ạ ỏ ặ ằ ọ ị trong c c qua lố ướ ọi l c sang m t c c khác, r i chia dung d ch phân vào đ y ộ ố ồ ị ầ các l penicillin. ọ
L y phi n kính đ y lên sau 25 - 30 phút, đ i noãn nang sẽ n i lên ấ ế ậ ợ ổ bám vào phi n kính, l y ra và đ y lamen, soi dế ấ ậ ưới kính hi n vi v t kính 40xể ậ đ tìm noãn nang c a ể ủ Cryptosporidium spp..
Tuy nhiên, v i phớ ương pháp này khó xác đ nh đị ược noãn nang c a ủ
Cryptosporidium spp., vì v y đ xác đ nh noãn nang c a ậ ể ị ủ Cryptosporidium spp.
chúng ta thường s d ng phử ụ ương pháp nhu m acid nhanh c i ti n (Ziehl ộ ả ế Neelsen).
Phân l p noãn nang t phân b ng phậ ừ ằ ương pháp nhu m Ziehl ộ Neelsen
Trong các phương pháp phát hi n noãn nang ệ Cryptosporidium spp.
trong phân thì người ta thường s d ng phử ụ ương pháp nhu m acid nhanh ộ c i ti n (Ziehl Neelsen). Vì đây là phả ế ương pháp truy n th ng d ti n hành ề ố ễ ế và u đi m c a phư ể ủ ương pháp này là hi u qu đ phát hi n s có m t c a ệ ả ể ệ ự ặ ủ noãn nang [1].
Nguyên t c c a phắ ủ ương pháp nhu m Ziehl Neelsen c i ti n là: ộ ả ế
Cryptosporidium spp. khó xác đ nh b ng cách soi phân tr c ti p. Vì v y, ị ằ ự ế ậ người ta dùng phương pháp nhu m đ t o ra s khác bi t gi a màu c a kýộ ể ạ ự ệ ữ ủ sinh trùng trên n n màu c n bã phân. Kỹ thu t nhu m Ziehl Neelsen c i ề ặ ậ ộ ả ti n đế ược dùng d a trên đ c đi m kháng acid c a ự ặ ể ủ Cryptosporidium spp..
Nguyên t c c a kỹ thu t này là nhu m tiêu b n phân b ng cacbon fuchsin, ắ ủ ậ ộ ả ằ sau đó t y màu b ng alcohol acid và nhu m n n tiêu b n b ng methylen ẩ ằ ộ ề ả ằ blue 1 %. Do có tính kháng acid nên các trùng bào t gi l i màu h ng c a ử ữ ạ ồ ủ cacbon fuchsin. Do Cryptosporidium spp. có hai l p v ngoài c ng có th ớ ỏ ứ ể ch ng l i đố ạ ược nh ng y u t lý hóa và c h c nên khi nhu m ph c h p ữ ế ố ơ ọ ộ ứ ợ
màu cacbon fuchsin c n đun nóng ph t nhu m v i dung d ch màu cacbon ầ ế ộ ớ ị fuchsin, nh đó mà cacbon fuchsin th m vào hai l p v ngoài đ nhu m ờ ấ ớ ỏ ể ộ màu, ph c h p này sẽ không b t y màu b i dung d ch t y màu m nh (acid,ứ ợ ị ẩ ở ị ẩ ạ alcohod acid) [60].
Kỹ thu t nhu m Ziehl Neelsen c i ti n có th áp d ng cho phân tậ ộ ả ế ể ụ ươi, ho c phân đặ ượ ố ịc c đ nh trong formon, ho c các b nh ph m khác nh d ch ặ ệ ẩ ư ị hút tá tràng, m t, đ m [ậ ờ 60]. Tuy nhiên, nhược đi m c a phể ủ ương pháp này là không phân bi t đệ ược noãn nang c a t ng loài c th , chính vì th đ ủ ừ ụ ể ế ể kh c ph c đắ ụ ược nhược đi m này ngể ười ta thường s d ng nh ng phử ụ ữ ương pháp trong phòng thí nghi m khác.ệ
b. Huy t thanh h cế ọ Phương pháp ELISA
ELISA (Enzyme – Linked Immuno Sorben Assay) hay còn có m t tên ộ g i khác là EIA (Enzyme Immuno Assay) là m t phọ ộ ương pháp phát hi n s ệ ự xu t hi n c a m m b nh trong m u xét nghi m. Ph n ng d a trên c ấ ệ ủ ầ ệ ẫ ệ ả ứ ự ơ ch mi n d ch, s k t h p gi a kháng nguyên và kháng th , trong đó m t ế ễ ị ự ế ợ ữ ể ộ trong hai y u t sẽ k t h p v i enzyme, s d ng ch t ch th màu nh m ế ố ế ợ ớ ử ụ ấ ỉ ị ằ phát hi n ph n ng dệ ả ứ ương tính. Đây là m t trong nh ng phộ ữ ương pháp đượ ức ng d ng r ng rãi trong ch n đoán thú y [ụ ộ ẩ 7].
D a vào tính u vi t c a phự ư ệ ủ ương pháp ELISA, tác gi Inpankaew T. vàả c ng s (2009) đã s d ng protein kháng nguyên tái t h p P23 c a ộ ự ử ụ ổ ợ ủ C. parvum làm kháng nguyên cho ph n ng ELISA, nh m m c đích phát hi n ả ứ ằ ụ ệ kháng th ch ng l i ể ố ạ C. parvum trong huy t thanh bò đở ế ược thu th p t i ậ ạ nhi u vùng khác nhau c a Thái Lan [ề ủ 30].
Hi n nay, các lo i kháng nguyên khác c a ệ ạ ủ Cryptosporidium spp. đã
được tìm th y trong phân thông qua KIT ELISA phát hi n kháng nguyên. ấ ệ Tùy theo các nhà s n xu t KIT, các kháng nguyên c a ả ấ ủ Cryptosporidium spp.
trong phân được phát hi n b ng cách cho liên k t v i kháng th đ n dòng ệ ằ ế ớ ể ơ ho c kháng th đa dòng. Các KIT ELISA sandwich phát hi n kháng nguyên ặ ể ệ ch a các thành ph n: Kháng th ch ng l i ứ ầ ể ố ạ Cryptosporidium spp. đượ ắc g n s n trên các gi ng c a khay ELISA, kháng th có g n enzyme (thẵ ế ủ ể ắ ường là hoseradish peroxidase), c ch t và ch t dùng ph n ng. Nh ng KIT này ơ ấ ấ ả ứ ữ được dùng đ phát hi n kháng nguyên ể ệ Cryptosporidium spp. trong m u ẫ
phân [61].
c. Sinh h c phân tọ ử
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Ph n ng này d a vào đ c tính c a enzyme DNA polymeraza: C n s ả ứ ự ặ ủ ầ ự hi n di n c a nh ng c p m i chuyên bi t đ ho t đ ng t ng h p m t ệ ệ ủ ữ ặ ồ ệ ể ạ ộ ổ ợ ộ m ch DNA m i t m ch khuôn [ạ ớ ừ ạ 7].
Đ th c hi n PCR nh m xác đ nh ể ự ệ ằ ị Cryptosporidium spp. trong m u ẫ b nh ph m, đi u nh t thi t c n làm là ph i tách đệ ẩ ề ấ ế ầ ả ược DNA c a noãn nang.ủ Giai đo n tách DNA là giai đo n khó nh t c a quá trình, vì noãn nang ạ ạ ấ ủ
Cryptosporidium spp. có c u trúc b n v ng, khó có th b phá v b i các ấ ề ữ ể ị ỡ ở hóa ch t trong các phấ ương pháp tách DNA thông thường khác [15]. Có nhi u phề ương pháp khác nhau đ b c l DNA c a noãn nang ể ộ ộ ủ
Cryptosporidium spp., ta có th s d ng phể ử ụ ương pháp tách chi t DNA t ng ế ổ s theo Protocol c a Elenice M.N Goncalves và cs (2009) [ố ủ 22].
Sau khi tách chi t đế ược DNA c a noãn nang ủ Cryptosporidium spp., ta
ti n hành quá trình nhân b n gen qua 3 bế ả ước: Gây bi n tính – g n primer –ế ắ kéo dài phân t . K t thúc quá trình nhân b n gen, bử ế ả ước ti p theo là đi n di ế ệ s n ph m thu đả ẩ ược trong th ch song song v i m t h n h p DNA d u phânạ ớ ộ ỗ ợ ấ t lử ượng. Nhu m DNA b ng ethidium bromide. Quan sát v ch phát quang ộ ằ ạ DNA dưới đèn c c tím và so sánh v i thang chu n đ đánh giá k t qu [ự ớ ẩ ể ế ả 8].
Phương pháp RT - PCR (Reverse Transcription - PCR)
Là phương pháp PCR mà nucleic acid đích c n ph i th c hi n là RNA. ầ ả ự ệ Đ th c hi n để ự ệ ược PCR này thì trước h t RNA ph i đế ả ược phiên mã ngược thành cDNA, sau đó dùng PCR khu ch đ i trình t đích trong cDNA b ng ế ạ ự ằ c p m i đ c hi u cho trình t này [ặ ồ ặ ệ ự 7].
Trong khi nghiên c u v ứ ềC. parvum t i Australia, Timothy Stinear và ạ cs (1996) đã nh n th y r ng vi c phát hi n ậ ấ ằ ệ ệ C. parvum trong m u nẫ ước là c c kỳ khó và tiêu t n nhi u th i gian, do v y các nhà nghiên c u này đã ự ố ề ờ ậ ứ phát tri n kỹ thu t Reverse Transcription – PCR đ phát hi n s có m t ể ậ ể ệ ự ặ c a noãn nang ủ C. parvum trong các m u nẫ ước đã được ly tâm. Kỹ thu t này ậ d a trên s phát hi n mRNA t m t protein shock (hsp) nhi t c a ự ự ệ ừ ộ ệ ủ C.
parvum. T ng h p protein này b ng cách m u ch a noãn nang t i 45ổ ợ ằ ủ ẫ ứ ạ oC trong th i gian ng n, sau đó ly gi i noãn nang b ng chu trình đông – rã ờ ắ ả ằ đông. Hsp 70 mRNA đượ ảc s n xu t t các noãn nang còn s ng, sau quá ấ ừ ố
trình phiên mã ngược thành đo n gen ạ hsp 70. Quá trình RT – PCR sẽ được th c hi n v i c p m i đ c hi u. Các c p m i này sẽ s n xu t s n ph m ự ệ ớ ặ ồ ặ ệ ặ ồ ả ấ ả ẩ PCR v i kích thớ ước 590 bp. Trình t c a c p m i nh sau [ự ủ ặ ồ ư 56]:
Primer Chsp1: 5’ – AGCAATCCTCTGCCGTACAGG – 3’ Primer Chsp 4: 5’ – AAGAGCATCCTTGATCTTCT – 3’
Đ u tiên, ph n ng phiên mã ngầ ả ứ ược sẽ được th c hi n v i primer ự ệ ớ Chsp4, 3 µl m u sẽ đẫ ược cho vào 30 µl dung d ch ch a 5 mM MgClị ứ 2, 10 mM Tris- HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1mM deoxynucleoside triphotphates
(dNTPs), 1 U RNasin, 2,5 U murine leukemia virus reverse transcriptase, 25 mM Chsp 4 và 1 µl internal positive control RNA. M u sẽ đẫ ượ ủ ạc t i 42oC trong 30 phút, và sau đó là quá trình b t ho t enzyme t i 90ấ ạ ạ oC trong 5 phút [56].
Ti p theo 10µl m u t ph n ng phiên mã ngế ẫ ừ ả ứ ược, 1.25 mM MgCl, 10 mM Tris – HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1 U ampi – Taq polymerase, 2,5 mM primer Chsp 1 và nước tinh khi t cho đ lế ủ ượng cu i cùng c a ph n ng là ố ủ ả ứ 20 µl. Quá trình khu ch đ i đế ạ ược th c hi n v i protocol nh sau:ự ệ ớ ư
94oC trong 15 giây, 68oC trong 30 giây trong 5 chu kỳ. 90oC trong 5 giây, 64oC trong 30 giây trong 5 chu kỳ.
90oC trong 5 phút, 58oC trong 15 giây, 72oC trong 15 giây, 72oC trong 1 phút th c hi n 25 chu kỳ.ự ệ
Đ bi t k t qu , 10 µl s n ph m khu ch đ i để ế ế ả ả ẩ ế ạ ược đi n di trong ệ agarose gel 1,2% trong môi trường TEA 1X (40 mM Tris – acetate, 1 mM EDTA) trong 30 phút v i dòng đi n 60 mA. Sau đó b n gel sẽ đớ ệ ả ược nhu m ộ trong ethidium bromide và đ c dọ ưới tia UV [56].
2.4.5. Phòng và tr b nhị ệ2.4.5.1. Phòng b nhệ