(RNAi)
Hội nghị hoa hồng thế giới 2006 được tổ chức tại thành phố Osaka từ ngày 11- 17/5/2006. Trong hội nghị ban tổ chức đưa ra triển lãm nhiều giống hoa hồng mới rất đẹp và ấn tượng. Tuy nhiên nổi trội nhất trong hội nghị lần này chính là hoa hồng xanh được tạo ra bằng kỹ thuật RNAi do sự hợp tác giữa các nhà khoa học của hai công ty Florigene và Suntory dưới sự trợ giúp về mặt kỹ thuật của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Úc Châu (CSIRO).
Hoa hồng xanh có thể được coi là chén thánh (Holy Grail) của những nhà lai tạo hoa hồng kể từ năm 1840. Khi đó hiệp hội làm vườn của Anh và Bỉ đã treo giải thưởng 500.000 francs cho người đầu tiên tạo được hoa hồng màu xanh.
Các nhà di truyền học phân tử của công ty Florigene và Suntory đã đoạt được giải thưởng này, một giải thưởng đã từng làm nhụt chí biết bao nhà lai tạo hoa hồng truyền thống bằng cách kết hợp một ít yếu tố cũ, một ít yếu tố mới, một ít yếu tố vay mượn và cuối cùng là một ít yếu tố tạo ra màu xanh. Yếu tố tạo ra màu xanh trên hoa hồng chính là gen delphinidin mà các nhà di truyền của công ty Florigene đã clone từ loài hoa păng-xê để tổng hợp trực tiếp màu xanh trên cây hoa hồng. Yếu tố vay mượn chính là gen
iris nhằm tạo ra enzyme DFR (the dihydroflavonol reductase), enzyme này
sẽ hoàn thành chu trình phản ứng tổng hợp delphinidin trên hoa hồng. Yếu tố mới chính là một gen nhân tạo. Gen này được tạo ra bởi nhóm các nhà di truyền học của công ty Suntory bằng kỹ thuật mới là RNA interference, viết tắt là RNAi. Kỹ thuật này được tư vấn bởi viện CSIRO nhằm mục đích tắt sự hoạt động của gen hình thành màu đỏ trong hoa hồng. Chính gen này đã đánh bại những nỗ lực của nhóm nghiên cứu Florigene nhằm làm hoạt hóa
nhà khoa học của Suntory đã tạo ra một gen “câm lặng” để vượt qua sự khó khăn này bằng kỹ thuật RNAi.
Trong cây trồng có một loại phân tử được gọi là anthocyanin được
coi là sắc tố chủ đạo trên hoa, trái và các mô tế bào khác. Thông thường, các màu chính của hoa bắt nguồn từ anthocyanin với sự có mặt của một ít các chất carotenoid màu vàng. Ngoài ra, anthocyanin dihydrokaempferol (DHK) lại là một enzyme chi phối cho cả 3 chu trình hình thành sắc tố trên cây trồng bao gồm: cyanidin, pelargonidin và delphinidin. Gen cyanidin mã hóa một enzyme làm thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành chu trình cyanidin dẫn đến biểu hiện các màu đỏ, hồng hay màu tím hoa cà. Trong khi đó gen delphinidin không hiện diện trong cây hoa hồng sẽ mã hóa một enzyme khá tương đồng cho việc thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành sự tổng hợp màu theo chu trình delphinidin. Một loại enzyme khác có tên gọi là
dihydroflavinol reductase (DFR) sẽ hỗ trợ các màu chỉ thị trong cả ba chu
trình trên. Enzyme này rất quan trọng vì không có nó sẽ không thể tạo màu trên các cánh hoa. Chính vì vậy mà các đột biến gen DFR đều cho ra những hoa có màu trắng. Trong hoa hồng không có gen delphinidin để hình thành màu theo chu trình của nó. Chu trình delphinidin có thể hình thành màu đỏ hoặc xanh trên hoa dưới sự tác động của DRF và pH.
Để tạo ra một bông hồng màu xanh, các nhà nghiên cứu Florigene cần một loại bông hồng trắng trong đó gene DFR đã bị bất hoạt. Vào năm 2001, TS.Waterhouse đã thảo luận việc sử dụng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế một gen mong muốn để sau đó có thể thay thế bằng một gen khác. Do đó, các nhà khoa học của công ty Florigene ngay lập tức nhận ra được lợi ích của việc dùng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế hoạt động của gen DFR trong hoa hồng đỏ dẫn đến ức chế chu trình cyanidin và sau đó chuyển gen delphinidin với một gen DFR hoàn toàn mới nhằm hoàn chỉnh chu trình tổng hợp
delphinidin trong hoa hồng. Cùng lúc đó các nhà nghiên cứu của công ty Suntory, Nhật Bản cũng có cùng ý tưởng bằng cách dùng kỹ thuật RNAi để ức chế gen DFR sau đó họ tạo dòng (clone) một gen delphinidin mới từ loài hoa păng-xê (pansy) và gen DFR từ hoa iris. Các gen DFR của hoa hồng và iris khá tương tự nhau và chia sẻ nhiều đoạn mã DNA, nhưng kỹ thuật RNAi cũng rất tinh tế bởi vì nó có thể ức chế gen DFR của hoa hồng mà không ảnh hưởng đến gen DFR của hoa iris bằng việc tạo ra một cấu trúc ức chế gen có tác dụng tạo ra các phân tử dsRNA kẹp tóc (hairpin dsRNA) với trình tự tương đồng với gen DFR của hoa hồng.
Vì thế để tạo ra bông hồng xanh, các nhà khoa học của Suntory đã áp dụng một bộ 3 gen. Một gen nhân tạo được dùng cho kỹ thuật RNAi nhằm ức chế gen DFR của hoa hồng làm cho hoa hồng không biểu hiện màu. Sau đó chuyển gen delphinidin từ loài hoa păng-xê và gen DFR từ loài hoa iris sẽ tạo ra hoa hồng có hàm lượng delphinidin rất cao trong cánh hoa. Tuy nhiên, cũng phải lưu ý một yếu tố ảnh hưởng đến màu xanh trên cánh hoa đó chính là độ pH tế bào và đó là một trong những lý do chính là tại sao các loài hoa có cùng chu trình anthocyanin nhưng lại có màu khác nhau. Khi nồng độ pH tế bào mang tính kiềm thì sắc tố của anthocyanin thường trở nên xanh hơn. pH của đất không ảnh hưởng hay ảnh hưởng rất ít đến pH tế bào cánh hoa. Nồng độ pH tế bào cánh hoa thường mang tính di truyền. Cánh hoa hồng thông thường có nồng độ pH khoảng 4,5. Chính vì vậy, để tạo ra các cánh hoa hồng có nồng độ pH thấp thì rất hạn chế. Vì vậy, các nhà khoa học mới nghĩ đến kỹ thuật ức chế gen bằng kỹ thuật RNAi nhằm xác định những gen ảnh hưởng đến tính axít của cánh hoa hay điều chỉnh màu của cánh hoa theo những hướng khác.
Hình 11. Quy trình hình thành bông hồng xanh với sự hỗ trợ của kỹ thuật RNAi. Nguồn hình từ CSIRO (http://www.csiro.au/files/files/p29z.pdf).
Hình 12. Hoa hồng xanh (blue rose)
Bông hồng xanh là một trong những sản phẩm được tạo ra từ việc ứng dụng kỹ thuật RNAi. Đây là một trong hàng loạt ứng dụng của RNAi trong nghiên cứu y sinh và là công cụ rất hữu ích cho việc tìm hiểu và khám phá các chức năng bí ẩn của các gen trong thời đại nghiên cứu hậu genome (post- genomic era).
C. KẾT LUẬN
Công nghệ tạo cây trồng chuyển gen ngày càng phát triển và tạo ra hàng trăm giống cây trồng chuyển gen khác nhau mang nhiều đặc tính quý
Tuy nhiên vấn đề cây trồng chuyển gen (GMOs- Genetically Modified Organisms) còn là vấn đề tranh cãi, thậm chí còn gặp phải sự phản đối gay gắt từ nhiều nhà khoa học. Sản phẩm chuyển gen bị nhiều người tiêu dùng lo ngại. Các sản phẩm chuyển gen phải được dán nhãn để những người
tiêu dùng lựa chọn. Nhiều nước chưa cho phép nhập khẩu các sản phẩm chuyển gen cũng như cây trồng chuyển gen.
Các phương pháp nhận biết GMOs và cấu trúc phân tử của GMOs
Việc nhận biết GMOs là rất cần thiết đối với nhiều ứng dụng như để
đánh giá mức độ sạch của hạt giống hay đối với việc bắt buộc dán nhãn thực phẩm ở một số quốc gia. Vì thế nhiều kỹ thuật phân tích đã và đang được phát triển để đáp ứng nhu cầu này.
Việc phát hiện GMOs và dẫn xuất của nó có thể được thực hiện nhờ sự nhận biết phân tử (ADN, ARN hoặc protein) mà những phân tử này có nguồn gốc từ gen được chèn (hoặc gen được biến đổi) .Có ba phương pháp để xác định GMOs đó là: phương pháp khuyếch đại dựa trên cơ sở nucleotit; phương pháp dựa trên cở sở protein; phương pháp dựa trên cơ sở phát hiện hoạt tính enzym.
* Phương pháp khuếch đại dựa trên cơ sở nucleotit: bao gồm kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phản ứng LCP (Ligase Chain Reaction), khuếch đại dựa trên trình tự axit nucleic (NASBA), kỹ thuật dấu vân tay (RFLP, AFLP, RAPD…), lai mẫu dò, sao chép trình tự duy trì liên tục (3SR) và khuếch đại enzym sao chép Q.
* Phương pháp dựa trên cơ sở protein: bao gồm điện di gel SDS một
chiều, điện di gel SDS hai chiều, phân tích Western blot và kỹ thuật ELISA (Enyme linked immunosorbent assays).
* Phương pháp dựa trên cơ sở phát hiện hoạt tính của enzym: phương pháp này không thích hợp với các thực phẩm đã qua chế biến bởi vì lúc này protein đã bị biến tính.
Cho đến nay các phương pháp chính đã phát triển để phát hiện GMOs và các dẫn xuất của GMOs chủ yếu dựa trên việc phát hiện ADN, trong khi
chỉ một vài phương pháp đã được phát triển để phát hiện protein hoặc ARN. Điều này có rất nhiều lý do, ADN có thể được làm sạch và được nhân lên hàng triệu bản sao chỉ trong một thời gian ngắn nhờ kỹ thuật PCR. Việc phân tích ARN và protein là một quá trình phức tạp hơn và thời gian lâu hơn. ADN là phân tử rất bền vững, trong khi ARN lại không ổn định. Tính bền vững của protein lại rất khác nhau, phụ thuộc vào loại protein. Thường có mối tương quan giữa số lượng GMOs và ADN nếu như ADN biến đổi di truyền là ở trong nhân, mối tương quan này sẽ không xảy ra nếu ADN đó là ADN ở ngoài nhân (trong sinh vật nhân chuẩn, thể nhiễm sắc hoặc ngoài nhiễm sắc thể ở sinh vật nhân sơ). Trong khi đó lại không có nhiều mối tương quan giữa số lượng GMOs và protein hoặc ARN. Cuối cùng là ngay bản thân cơ thể bị biến đổi di truyền đã bị tác động ở mức ADN. Hiện nay, hầu như tất cả các GMOs đã được thương mại hoá đều là cơ thể bị biến đổi ADN ở trong nhân.
Tuy có nhiều kỹ thuật khác nhau nhưng mỗi kỹ thuật lại có tính đặc hiệu và mặt hạn chế riêng của nó.
Phương pháp dựa trên cơ sở protein
Phương pháp này nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa protein và kháng thể. Kháng thể chính là tác nhân bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn và virus. Khi kháng thể nhận ra phân tử lạ thì sẽ liên kết với phân tử này, và trong các phân tích phát hiện GMOs thì sự phức tạp của mối liên kết lần lượt được nhận biết nhờ phản ứng hình thành sắc tố. Đây chính là kỹ thuật ELISA, kháng thể cần thiết để nhận biết protein có thể không được sinh ra nếu không nhận được protein sạch. Protein này phải được làm sạch từ ngay bản thân GMOs hoặc nó có thể được tổng hợp trong thư viện nếu như thành phần axit amin của protein được biết rõ. Kỹ thuật phát hiện
protein đặc hiệu sử dụng ELISA rất thích hợp với việc phân tích đối với nguyên liệu thô.
Phương pháp khuyếch đại dựa trên cơ sở nucleotit
+ Phương pháp dựa trên cơ sở ARN: là phương pháp nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa phân tử ARN và phân tử ADN hoặc ARN tổng hợp còn gọi là đoạn mồi (primer). Primer phải bổ sung với trình tự nucleotit ở điểm khởi đầu của phân tử ARN. Kết quả phân tử tách đôi tương tự như ADN. Thường thì sự liên kết giữa ARN và primer sẽ dẫn đến sự chuyển hóa phân tử ARN thành phân tử ADN thông qua quá trình sao chép ngược. Cuối cùng, ADN có thể được nhân lên nhờ PCR. Hoặc ARN được phiên mã thành hàng trăm bản copy phân tử ARN gốc và quá trình này có thể được lặp lại nhờ sử dụng mỗi phân tử ARN copy như là một mẫu chuẩn trong kỹ thuật NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification).
+ Phương pháp dựa trên cơ sở AND: chủ yếu là nhờ vào sự nhân đôi của ADN đặc hiệu với kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này được dùng để xác định các sản phẩm GM, với đoạn mồi (primer) được thiết kế dựa trên trình tự điều tiết hoặc gen cấu trúc trên đoạn gen chuyển. Các đoạn primer thiết kế này có một vài đặc điểm đặc biệt và có thể được sử dụng để sàng lọc sản phẩm và phát hiện sản phẩm đặc hiệu. Hai mạch ADN tổng hợp có vai trò quan trọng trong chuỗi phản ứng trùng hợp này, mỗi một mạch ADN bổ sung với một mạch của cặp mồi. Primer thứ nhất sẽ cặp đôi đầu tiên và mã hoá cho chuỗi ADN được nhân đôi, trong khi đó primer thứ 2 sẽ bắt cặp với mạch ADN còn lại và không mã hoá chuỗi ADN. Trong phản ứng PCR, giai đoạn đầu tiên của 1 chu kỳ: phân tử ADN sẽ tách đôi. Giai đoạn 2, sẽ diễn ra sự bắt cặp giữa 2 đoạn primer với chuỗi ADN bổ sung của chúng. Giai đoạn 3 là sự tạo thành 2 bản sao hoàn hảo của chuỗi ADN gốc nhờ sự bổ sung nucleotit thích hợp để kết thúc mỗi đoạn primer. Khi 1 chu trình được hoàn thành thì
ta có thể lặp lại chu trình này, và cứ mỗi một chu kỳ kết thúc thì số lượng bản sao lại tăng lên gấp đôi, kết quả là sản phẩm được khuếch đại rất nhanh. Sau 20 chu kỳ, số lượng bản sao đã tăng gấp 1 triệu lần. Tuy nhiên, ở chu kỳ nhất định nào đó thì số lượng sản phẩm khuếch đại sẽ bị ức chế, không tăng lên nữa.
Kỹ thuật PCR không thích hợp để phát hiện đối với thực phẩm đã qua chế biến ở mức độ cao bởi vì khi ấy các đoạn ADN trong thực phẩm có thể bị đứt thành những mảnh nhỏ. Tuy nhiên, PCR là kỹ thuật phổ biến được sử dụng rất rộng rãi, bởi nó là một phương pháp nhạy và có tính đặc hiệu cao, có thể phát hiện được axit nucleic ngay ở khối lượng rất nhỏ. Kỹ thuật PCR không chỉ được sử dụng để xác định các sản phẩm GM mà nó còn được sử dụng vào mục đích định lượng, định tính. Vì thế mà có quantitative- PCR, multiplex- PCR, real- time PCR, qualitative- PCR… Để tuân theo ngưỡng dán nhãn đối với GMOs có trong các thành phần thực phẩm, real- time PCR, quantitative competitive PCR (QC- PCR) đã được ứng dụng ở nhiều phòng thí nghiệm để kiểm soát chính thức các sản phẩm thực phẩm.
Khi đưa gen chèn vào trong cơ thể thực vật thì gen này thường chứa các trình tự điều khiển và chứa gen đặc hiệu (gen quy định tính trạng mong muốn). Hiện nay, hầu hết các thực vật chuyển gen đều có chứa trình tự khởi động promoter 35S CaMV (small subunits of cauliflower mosuic virus) của virus khảm súp lơ và đoạn kết thúc terminator NOS (Nopalin synthase) của plasmid vi khuẩn Agrobacterium, và trình tự mã hoá của chính gen được chuyển. Chính vì vậy mà khi sử dụng PCR để xác định xem đó có phải là GMOs hay không, thì thường sử dụng cặp primer 35S hoặc primers NOS hoặc primers đặc hiệu cho gen chuyển, primer này có thể tổng hợp một phần hay toàn bộ trình tự của gen này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trần Quốc Dung
Công nghệ chuyển gen ĐH Huế, 2006
2. Trịnh Đình Đạt
Công nghệ sinh học. Tập bốn. NXB Giáo dục.
4. http://agbiotech.com.vn
5. http://sinhhocvietnam.com.vn
6. http://isa-cnsh.org
7. http://www.hcmbiotech.com.vn