3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thu mẫu
Tất cả các mẫu cá khảo sát đƣợc đánh bắt bằng lƣới kéo, kích thƣớc mắt lƣới từ 3 đến 10 cm. Độ sâu của nƣớc ở các điểm thu mẫu khoảng từ 15 –
100 m. Đối với mỗi địa điểm thu mẫu, cá đƣợc thu hai lần, lần một vào tháng 12 năm 2020 (mùa mƣa) và lần hai vào tháng 3 năm 2021 (mùa khô). Tuy nhiên, các loài cá đƣợc thu không đồng nhất ở các điểm do sự xuất hiện theo mùa và tùy thuộc các vùng biển khác nhau. Cụ thể số lƣợng cá mỗi loài thu ở các điểm thu nhƣ sau:
Điểm thu mẫu Loài cá Số lƣợng thu lần 1 (cá thể) Số lƣợng thu lần 2 (cá thể) Z1 Cá bống 10 10 Cá cơm 10 10 Cá trích 10 10 Z2 Cá cơm 10 10 Cá nục 10 10 Cá phèn 10 10 Z3 Cá bống 10 10 Cá cơm 10 10 Cá nục 10 10 Z4 Cá bống 10 10 Cá cơm 10 10 Cá nục 10 10 Tổng cộng 120 120
2.4.2. Phương pháp bảo quản mẫu
Cá đƣợc đông lạnh trong vòng 2 giờ ngay sau khi đánh bắt, sau đó mang về bảo quản đông lạnh ở phòng thí nghiệm, và đƣợc rã đông ở nhiệt độ phòng trƣớc khi phân tích.
2.4.3. Phương pháp mổ khảo sát ô nhiễm vi nhựa trong ống tiêu hóa của cá
đƣợc làm sạch bằng cồn, vệ sinh tay trƣớc khi tiến hành mổ mẫu cá. Sử dụng các dụng cụ và thiết bị bằng thủy tinh hoặc kim loại để lấy mẫu và phân tích. Găng tay (găng nitrile) đƣợc mang trong suốt quá trình mổ, dụng cụ mổ và các vật dụng khác đƣợc làm sạch sau mỗi mẫu đƣợc mổ. Để giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn, luôn luôn thực hiện thí nghiệm trong phòng kín, tránh gió lùa, mở điều hòa trƣớc khi bắt đầu mổ 30 phút, không bật quạt trong phòng thí nghiệm.
Cá sau khi rã đông đƣợc vệ sinh sạch sẽ. Đối với mỗi mẫu cá, các phép đo cơ bản đƣợc ghi lại bao gồm chiều dài từ miệng đến điểm trung tâm của đuôi (cm) và khối lƣợng cơ thể (g).
Các mẫu cá đƣợc mổ bằng dao mổ, ống tiêu hóa của cá đƣợc lấy ra bằng cách bóc tách từng ống, từ đỉnh thực quản và cắt ngay ở hậu môn. Sau đó cắt mở ống tiêu hóa và ngay lập tức đặt vào trong cốc thủy tinh.
2.4.4. Phương pháp phân tích mẫu
Ống tiêu hóa đựng trong cốc thủy tinh đƣợc xử lý bằng dung dịch KOH 10% với một lƣợng lớn hơn 3 lần thể tích của phần ống tiêu hóa, bọc miệng cốc bằng nhôm lá mỏng rồi đặt vào tủ ấm 60o
C. Sau 3 - 5 ngày (72 - 120 giờ) ngâm mẫu trong tủ ấm, các thành phần hữu cơ (ống tiêu hóa và dịch trong ống tiêu hóa) đã đƣợc phân hủy hoàn toàn, thu đƣợc dung dịch ống tiêu hóa của từng mẫu cá có chứa vi nhựa. Mỗi cốc thủy tinh sau đó đƣợc lắc khoảng 20 lần để phá vỡ các vật liệu khó phân hủy nhƣ phần vỏ của động vật phù du hoặc tất cả các vật chất trôi nổi khác [49].
Sàng dung dịch trên ở cỡ mắc lƣới 1 mm: đối với thành phần >1 mm: dùng kẹp kim loại, gắp những mảnh nhựa nhìn thấy đƣợc cho vào giấy lọc GF/A và đặt trong đĩa petri, đóng nắp đĩa, ghi chú tên mẫu lên đĩa, loại bỏ các loại rác khác. Đối với thành phần < 1 mm: thành phần này nằm trong dung dịch thu đƣợc bên dƣới rây. Chuyển dung dịch này vào cốc thủy tinh, viết tên
mẫu lên cốc.
Tiếp theo, lọc mẫu trong các cốc đã xử lý trên qua rây 250 µm và sàng mẫu, loại bỏ các thành phần < 250 µm và giữ lại dung dịch chứa các thành phần > 250 µm.
Sau đó, dung dịch này đƣợc lọc qua màng lọc sợi thủy tinh (GF/A, kích thƣớc màng lọc 1.6 μm) bằng bơm chân không. Các vi nhựa sẽ đƣợc giữ lại trên màng lọc, thu từng màng lọc và bảo quản trong các đĩa petri thủy tinh có nắp đậy để xác định các đặc điểm của vi nhựa. Giữ các đĩa petri trong tủ bảo quản và không đƣợc đặt đĩa ngƣợc lại. Sử dụng kính hiển vi soi nổi Leica S9i và máy tính đƣợc cài đặt phần mềm LAXS ® để quan sát, phân tích và chụp ảnh các hạt vi nhựa trên từng màng lọc. Kích thƣớc của tất cả các hạt vi nhựa đƣợc đo bằng phần mềm LASX ®.
Đối với các sợi vi nhựa có chiều dài nhỏ hơn 300 μm và các mảnh có diện tích nhỏ hơn 45,000 μm2, rất khó để phân biệt bằng mắt thƣờng các đặc điểm và bản chất của chúng, nên nghiên cứu này giới hạn kích thƣớc của vi nhựa trong khoảng từ 300 μm đến 5 mm đối với sợi và từ 45000 μm2
(300 μm × 150 μm) đến 25.000.000 μm2
(5000 μm × 5000 μm) đối với các mảnh[62]. Tất cả các dụng cụ và thiết bị đƣợc làm sạch hoàn toàn bằng cồn 96o
trƣớc khi sử dụng. Mỗi màng lọc đƣợc quan sát trong 10 phút, khi quan sát thấy bất kỳ vật phẩm nào xác định là vi nhựa (không phải các bộ phận của động vật nguyên sinh, tảo, đá hay các động vật khác) tiến hành chụp ảnh, đo kích thƣớc (chiều dài đối với sợi và diện tích đối với mảnh), ghi lại màu sắc và hình dạng của vi nhựa.
2.4.5. Phương pháp kiểm soát chất lượng
+ SAC (Sieving Atmospheric Control): Kiểm soát ô nhiễm vi nhựa từ không khí trong quá trình lọc mẫu.
petri mới.
• Để đĩa petri mở trong suốt thời gian thực hiện tất cả các bƣớc. Lƣu ý rằng một giấy lọc sẽ đƣợc sử dụng cho tất cả các bƣớc kiểm soát. Khi mỗi bƣớc kết thúc, đóng đĩa petri.
• Quan sát giấy lọc SAC, giống nhƣ khi thực hiện một mẫu thực để xem có bị nhiễm vi nhựa hay không.
+ OAC (Observation Atmospheric Control): Kiểm soát ô nhiễm vi nhựa từ không khí trong quá trình quan sát mẫu.
• Trong quá trình quan sát một giấy lọc (mẫu) ở kính hiển vi soi nổi, đặt một giấy lọc GF/A mới vào đĩa petri mới và để đĩa petri mở trong suốt quá trình quan sát mẫu.
• Khi quá trình quan sát mẫu kết thúc thì đóng đĩa petri.
• Quan sát giấy lọc OAC giống nhƣ khi thực hiện một mẫu thực để xem có bị nhiễm vi nhựa hay không.
+ PEC (Positive Extraction Control): Kiểm soát hiệu quả của quá trình xử lý mẫu. Trong một mẫu cần xử lý, thêm vào 10 mảnh vi nhựa đã biết đƣợc kích thƣớc và màu sắc.
• Tiến hành xử lí và phân tích mẫu theo quy trình chuẩn nhƣ trên. • Trong quá trình quan sát mẫu, tiến hành quan sát, đếm số mảnh vi nhựa đối chứng thu đƣợc để xác định hiệu quả xử lý mẫu.
2.4.6. Phương pháp xác định vi nhựa khi quan sát mẫu qua kính hiển vi soi nổi Leica S9i
- Đối với vi nhựa dạng sợi: là một đoạn dài có độ dày bằng nhau trong suốt chiều dài của chúng, không thuôn nhọn về phía cuối, ở dạng uốn cong ba chiều.
- Đối với vi nhựa dạng mảnh: là các mảnh cứng có hình dạng bất thƣờng trông giống nhƣ bị vỡ ra từ các mảnh lớn hơn, hoặc mảnh nhựa dẻo,
phẳng với các cạnh nhẵn hoặc góc cạnh.
Tất cả sợi và mảnh vi nhựa đều không nhìn thấy cấu trúc tế bào hoặc cấu trúc hữu cơ. Chúng có màu sắc rõ ràng và đồng nhất [30].
2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các dữ liệu đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp thống kê sinh học thông qua phần mềm MS Excel 2016 và phần mềm SPSS Version 2:
- Xác định giá trị trung bình ( ̅) theo công thức:
̅ = ∑ - Độ lệch chuẩn tính theo công thức:
S = √∑ni 1( - ̅)2
n-1 ( n<30)
Sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các nghiệm thức đƣợc đánh giá theo phân tích phƣơng sai một chiều ANOVA với mức ý nghĩa p <0.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu
3.1.1. Số lượng vi nhựa
Có tổng cộng 2987 vi nhựa trên tổng số 240 mẫu cá thuộc 6 loài đƣợc phân tích, bao gồm: cá bống (có 2 loài: cá bống cát (Glossogobius aureus) và cá bống thệ (Oxyurichthys ophthalmonema)), cá cơm (Stolephorus
commersonnii), cá nục (Decapterus macrosoma), cá phèn(Upeneus
moluccensis) và cá trích (Sardinella gibbosa). Trong đó vi nhựa dạng sợi là
loại chủ yếu với số lƣợng 2225 sợi, chiếm 74,5% và còn lại là dạng mảnh chiếm 25,5%. Các dạng vi nhựa khác (bọt, màng phim, hạt) không đƣợc tìm thấy ở tất cả các mẫu phân tích trong nghiên cứu này.
Qua phân tích 240 mẫu cá và quan sát, chúng tôi phát hiện thấy cá thể có số lƣợng vi nhựa thấp nhất là 1 vi nhựa ở cá bống, cá thể này đƣợc thu tại Z1 (Đầm Thị Nại) và 1 vi nhựa ở cá cơm, thu mẫu tại Z2 (biển Đề Gi); đồng thời cá thể có số lƣợng vi nhựa cao nhất trong số các mẫu cá là cá trích thu tại Z1 với 49 vi nhựa đƣợc tìm thấy. Số lƣợng vi nhựa cao nhất và thấp nhất ở từng loài thể hiện cụ thể trong bảng sau:
Bảng 3.1. Số lƣợng vi nhựa thấp nhất và cao nhất quan sát đƣợc ở từng loài cá
TT Cá Số cá thể phân tích Số lƣợng vi nhựa thấp nhất Số lƣợng vi nhựa cao nhất 1 Cá bống 60 1 32 2 Cá cơm 80 1 37 3 Cá nục 60 2 35 4 Cá phèn 20 4 19 5 Cá trích 20 3 49
So với một số nghiên cứu trƣớc đây về vi nhựa trong đƣờng tiêu hóa của cá, trong nghiên cứu của Filipa Bessa và cộng sự (2018) về sự xuất hiện vi nhựa trong cá ở môi trƣờng cửa sông Mondego (Bồ Đào Nha), có tối đa 14
vi nhựa/cá thể đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa của cá [33], và theo nghiên cứu của Lusher A.L. (2013) về sự xuất hiện vi nhựa trong đƣờng tiêu hóa ở cá tầng mặt và cá tầng đáy tại eo biển Manche – Anh, số vi nhựa tìm thấy ở mỗi cá thể dao động từ 1 đến 15 [51], trong nghiên cứu của Kosuke Tanaka & Hideshige Takada (2016) về vi nhựa trong đƣờng tiêu hóa của cá cơm ở vùng Vịnh Tokyo (Nhật Bản) có tối đa 15 vi nhựa/cá thể [49], nhận thấy số lƣợng vi nhựa tối đa trên cá thể trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn rất nhiều. Bên cạnh đó, đối với kết quả của Olgaç Güven và cộng sự (2017) về vi nhựa trong đƣờng tiêu hóa của cá ở vùng lãnh hải Thổ Nhĩ Kỳ trên biển Địa Trung Hải, kết quả có từ 1 đến 35 vi nhựa/cá thể đƣợc phát hiện [63], và nghiên cứu vi nhựa trong đƣờng tiêu hóa ở một số loài cá ven sông (ba nhánh sông chính của Hồ Michigan, Hoa Kỳ) của McNeish R. E. (2018) có từ 8 đến 55 vi nhựa tìm thấy trên mỗi cá thể [58], những kết quả về sự dao động số lƣợng vi nhựa trên mỗi cá thể ở các nghiên cứu này tƣơng đồng với kết quả của chúng tôi.
Khi tiến hành thu mẫu, chúng tôi thực hiện thu mẫu hai lần trên mỗi điểm thu, cụ thể thu lần một vào tháng 12 năm 2020 là thời điểm mùa mƣa, và thu lần hai vào tháng 3 năm 2021 là thời điểm mùa khô ở Bình Định. Kết quả số lƣợng vi nhựa thống kê theo mỗi lần thu nhƣ sau:
Bảng 3.2. Số lƣợng vi nhựa theo từng thời điểm thu mẫu
Thời điểm thu mẫu Lần 1 - Tháng 12.2020 (mùa mƣa) Lần 2 - Tháng 3.2021 (mùa khô) Số lƣợng vi nhựa Sợi Mảnh Sợi Mảnh 1018 409 1207 353 Tỷ lệ 71,3% 28,7% 77,4% 22,6% Tổng cộng 1427 1560
Theo kết quả phân tích, nhìn chung cá nuốt phải vi nhựa vào mùa khô nhiều hơn so với mùa mƣa. Điều này hoàn toàn phù hợp với điều kiện tự
nhiên theo mùa tại tỉnh Bình Định. Vào mùa mƣa, nƣớc ở các sông suối đổ về biển nhiều, dòng chảy ở vùng ven bờ mạnh nên vi nhựa dễ bị khuếch tán, mật độ vi nhựa trong nƣớc không cao nên cá ít ăn phải. Trong mùa khô, với các dòng chảy yếu hơn, mật độ vi nhựa lơ lửng trong nƣớc biển cao nên cá dễ nuốt phải vi nhựa hơn. Bên cạnh đó, vào thời điểm thu mẫu tháng 12.2020, đây là khoảng thời gian có nhiệt độ trung bình tƣơng đối thấp và cƣờng độ ánh sáng yếu hơn so với thời điểm tháng 3.2021 tại tỉnh Bình Định, điều kiện tự nhiên này có thể làm giảm khả năng phân hủy của nhựa trong môi trƣờng nƣớc. Bên cạnh đó, vào mùa mƣa nƣớc lũ từ các con sông mang theo nguồn nhựa từ đất liền đổ về biển, sau thời gian vài tháng đến mùa khô, dƣới tác động của môi trƣờng biển, của các tác nhân sinh vật và phi sinh vật, trong đó nhiệt độ cao và cƣờng độ ánh sáng mạnh sẽ làm tăng khả năng chiếu xạ UV, đó là yếu tố quan trọng để phân hủy nhựa thành vi nhựa và lúc này vi nhựa trong môi trƣờng biển dồi dào hơn so với mùa mƣa [17].
Với kết quả nghiên cứu nhƣ trên, chúng tôi khẳng định rằng vi nhựa đã xâm nhập vào hệ sinh thái ven biển Bình Định, mức độ ô nhiễm vi nhựa trong ống tiêu hóa của cá rất cao và con ngƣời đã, đang và sẽ tiếp xúc với chúng. Đặc biệt trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ đi sâu phân tích các loài cá nhỏ mà ngƣời dân sử dụng ―nguyên con‖ để chế biến thức ăn, làm các loại mắm, nƣớc mắm,… mà không loại bỏ ruột, do đó con ngƣời phơi nhiễm với vi nhựa là vấn đề rất đáng lo ngại.
3.1.2. Mật độ vi nhựa
Vi nhựa đƣợc tìm thấy trong ống tiêu hóa của tất cả các mẫu cá thu đƣợc từ các vùng biển ven bờ tỉnh Bình Định với mật độ trung bình là 12,45(±7,6) vi nhựa/cá thể.
Vào mùa mƣa (12.2020), với số lƣợng vi nhựa quan sát thấy trong ống tiêu hóa của cá ít hơn so với số lƣợng vi nhựa ở mùa khô (3.2021), từ đó cho
kết quả mật độ vi nhựa khảo sát đƣợc lần lƣợt là 11,9 (±6,9) vi nhựa/cá thể vào mùa mƣa và 13 (±8,1) vi nhựa/cá thể vào mùa khô.
Chúng tôi thực hiện thống kê số lƣợng và mật độ vi nhựa xuất hiện ở từng loài cá. Kết quả đƣợc trình bày cụ thể trong bảng sau:
Bảng 3.3. Mật độ vi nhựa xuất hiện theo từng loài
TT Cá Số vi nhựa / số cá thể Mật độ vi nhựa (vi nhựa/cá thể) 1 Cá bống 708/60 11,8 (± 7,5) 2 Cá cơm 1003/80 12,5 (± 6,8) 3 Cá nục 780/60 13 (± 8,5) 4 Cá phèn 264/20 13,2 (± 4,6) 5 Cá trích 232/20 11,6 (± 9,5) Tổng cộng 2987/240 12,45 (± 7,6)
Mật độ vi nhựa xuất hiện theo loài dao động từ 11,6 (±9,5) vi nhựa/cá thể đến 13,2 (±4,6) vi nhựa/cá thể, trong đó mật độ vi nhựa cao nhất ở cá phèn và thấp nhất ở cá trích. Tuy nhiên chúng tôi nhận thấy sự chênh lệch mật độ vi nhựa giữa các loài cá không đáng kể, và với kết quả này cho thấy sự phân bố tƣơng đồng của vi nhựa trong ống tiêu hóa của các loài cá nhỏ ven bờ tỉnh Bình Định.
Khi thực hiện thống kê số lƣợng và mật độ vi nhựa xuất hiện theo từng điểm thu mẫu, kết quả cũng cho thấy vi nhựa phân bố có sự tƣơng đồng nhất định. Tại các điểm thu Z1, Z2 và Z4, mật độ vi nhựa xuất hiện trong ống tiêu hóa của cá có sự chênh lệch rất nhỏ và tƣơng đối đồng đều, dao động từ 11,03 (±7,1) đến 11,45 (±5,7) vi nhựa/cá thể, riêng tại điểm thu Z3 có mật độ vi nhựa cao nhất là 15,9 (±8,9) vi nhựa/cá thể.
Bảng 3.4. Mật độ vi nhựa xuất hiện ở mỗi điểm thu mẫu
Mã điểm thu Số sợi/Số mảnh Mật độ vi nhựa (vi nhựa/cá thể) Z1 482/202 11,4 (± 7,1) Z2 512/175 11,45 (± 5,7) Z3 709/245 15,9 (± 8,9) Z4 522/140 11,03 (± 7,1) Tổng cộng 2225/762 12,45 (± 7,6)
Chúng tôi tiến hành so sánh kết quả mật độ vi nhựa trên mỗi cá thể của nghiên cứu này với kết quả của các nghiên cứu ở một số loài sinh vật thủy sinh trƣớc đây tại Việt Nam để xác định mức độ nhiễm vi nhựa của một số loài cá nhỏ vùng ven biển Bình Định. Cụ thể, nghiên cứu của Phƣơng Ngọc Nam và cộng sự (2019) trên loài vẹm xanh Châu Á (Perna viridis)thuộc vùng nƣớc lợ tỉnh Thanh Hóa với mật độ vi nhựa là 2,6 (±1,14) vi nhựa trên mỗi cá thể [60]; và nghiên cứu của Kiều Lê Thủy Chung và cộng sự (2021) ở các loài tôm và cá tự nhiên (Metapenaeus ensis - tôm đất, Metapenaeus brevicornis - tôm bạc, Cynoglossus punchticeps – cá lƣỡi trâu, Scianidae - cá lù đù,
Polynemus melanochir - cá phèn, Pseudapocryptes elongatus - cá kèo,