3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3.2Phát hiện virus PLRV bằng phƣơng pháp RT-PCR
Các mẫu sau khi đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA sẽ đƣợc chọn ra để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR. Trong đề tài này chúng tôi chỉ thực hiện phản ứng RT- PCR trên đối tƣợng virus PLRV.
Tiêu chuẩn chọn mẫu để thực hiện RT-PCR - Dƣơng tính.
- Triệu chứng đƣợc quan sát phải đặc trƣng và biểu hiện ra ngoài. - Mẫu đƣợc bảo quản tốt (còn tƣơi).
Dựa trên những tiêu chí trên, ta chọn ra đƣợc 5 mẫu đại diện cho 5 phƣờng tại thành phố Đà Lạt - Phƣờng 5: Mẫu 148 - Phƣờng 8: Mẫu 97 - Phƣờng 9: Mẫu 45 - Phƣờng 11: Mẫu 92 - Phƣờng 12: Mẫu 10
Kỹ thuật RT-PCR đƣợc sử dụng là 2 bƣớc (two steps), tức là gồm giai đoạn tổng hợp cDNA (Reverse) và giai đoạn khuếch đại cDNA (PCR). Virus PLRV đƣợc phát hiện dựa trên một đoạn gen có kích thƣớc 336 bp, mã hóa cho phân tử protein vỏ. Quá trình thực hiện phải qua 2 giai đoạn: Ly trích RNA, tổng hợp và khuếch đại cDNA nhờ phản ứng RT-PCR.
Giai đoạn 1: Ly trích RNA
Quá trình ly trích RNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit ly trích RNA (The Aurum total RNA kit). Tuy nhiên để thực hiện đúng yêu cầu ta phải chuẩn bị trƣớc một số dụng cụ và hóa chất sau:
- Nƣớc phải đƣợc xử lý với DEPC để khử RNase. Cối chày phải đƣợc hấp khử trùng sau khi đã đƣợc tráng nƣớc chƣa khử DEPC.
- Đầu tip, eppendoff phải đƣợc xử lý sao cho đảm bảo vô trùng và không còn sự hiện diện của enzyme phân hủy RNA. Tất cả phải đƣợc chuẩn bị trƣớc khi ly trích một ngày.
*Quy trình ly trích
Thực hiện theo chỉ dẫn của bộ kit. Lƣu ý, một số hóa chất không đƣợc cung cấp cùng với kit nên ta phải chuẩn bị riêng. Ta phải chuẩn bị
- Polyvinyl pyrolidone (PVP) 2% -Tris base pH = 7,5
- Ethanol 70%, 100% - β - mercaptoethanol
- Pha DNase I từ dạng bột thành dạng lỏng - Pha low stringency
Các bƣớc tiến hành ly trích RNA
1. Cân khoảng 80 mg mẫu lá, cắt ra từng miếng nhỏ (< 5 mm). Nghiền mịn trong nitơ lỏng. Chú ý không để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền.
2. Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube 2 ml có nắp đậy (có sẵn trong kit). Cho 14 µl PVP 2% vào mỗi 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution).
3. Cho 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution) đã bỗ sung PVP 2% vào tube chứa mẫu và trộn đều bằng pipet từ 12 - 15 lần.
4. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 3 phút ở 4oC. Sau đó hút dịch nổi sang tube 2 ml (có trong kit).
5. Cho 700 µl ethanol 70% vào tube chứa dịch nổi, trộn đều bằng pipet cho đến khi dịch không còn phân lớp.
6. Cho dịch hòa tan RNA (elution solution) vào bể điều nhiệt ở 70o
C. Cho RNA binding column vào tube 2 ml không có nắp đậy.
7. Hút 700 µl dịch mẫu cho vào RNA binding column. Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi tube (thực hiện nhiều lần cho đến khi hết mẫu thì thôi).
8. Cho 80 µl ethanol 100% vào 20 ml dịch rửa nhẹ (low stringency).
9. Cho 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency) đã bổ sung ethanol 100% vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới.
10. Pha DNase I với 250 µl Tris base pH = 7,5, trộn đều.
11. Pha 5 µl DNase I với 75 µl dịch pha loãng DNase (DNase delution solution) cho một mẫu ly trích trong tube 1,5 ml.
Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNA binding column. Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới.
12. Thêm 700 µl dịch rửa mạnh (high stringency wash solution) vào RNA binding column.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC Loại phần dịch bên dƣới (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
13. Thêm 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency wash solution) vào RNA binding column.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC Loại phần dịch bên dƣới.
Ly tâm tiếp 60 giây với tốc độ 12000 vòng ở 4oC để loại hoàn toàn dịch rửa. 14. Cho RNA binding column vào tube 1,5 ml (có trong kit) có nắp đậy.
Cho 80 µl dịch hòa tan RNA (elution solution) đã ủ ở 70oC vào RNA binding column, giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 giây.
Ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 4oC để thu RNA tổng số. RNA đem ủ ở 4oC để dùng sau.
*Những lƣu ý khi ly trích
- Phải có khu vực làm việc riêng
- Trong quá trình ly trích, phải thao tác càng nhanh càng tốt - Thay bao tay thƣờng xuyên khi thấy cần thiết
Giai đoạn 2: Tổng hợp cDNA
Mẫu RNA đƣợc ly trích ở trên sẽ đƣợc dùng để chạy RT-PCR. Mục đích để khuếch đại 1 đoạn gen mã hóa cho phân tử protein vỏ của virus PLRV. Quy trình này gồm hai bƣớc (two steps).
Bƣớc 1: Tổng hợp cDNA
Tổng hợp cDNA theo hƣớng dẫn của bộ kit tổng hợp cDNA (iScript cDNA kit). Thành phần các loại hóa chất cho 1 phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc cho theo bảng dƣới đây. Đối với lƣợng RNA cho vào ta thay đổi thể tích từ 2 - 5 µl trong một phản ứng.
Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích
5X iScript reaction Mix Enzyme RNA Nƣớc 4 µl 1 µl 5 µl (1 - 5 µg) Cho vào để đủ 20 µl Tổng thể tích 20 µl
Chu kỳ nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA 25oC trong 5 phút
42oC trong 30 phút 85oC trong 5 phút Giữ ở 4oC
cDNA đƣợc tổng hợp (20 µl) có thể đem sử dụng ngay trong phản ứng PCR hoặc cất ở 4oC để chạy PCR sau.
Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA
Bƣớc này ta không sử dụng kit mà thực hiện theo nghiên cứu của Fattouma DJILANI và Hatem FAKHFAKH ở đại học Tuynidi vào năm 2002.
Thành phần hóa chất cho một phản ứng 25 µl đƣợc cho theo bảng dƣới đây
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA
Thành phần Nồng độ cuối
Dung dịch đệm PCR 10X MgCl2
Hỗn hợp dNTP (dNTP Mix) Mồi xuôi (sens primer) Mồi ngƣợc (antisens primer)
iTaq polymerase cDNA Nƣớc 1X 1 mM 0,2 mM 0,3 µM 0,3 µM 1 U/µl 2,5 - 5 µl Cho vào để đủ 25 µl Tổng thể tích 25 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR - 94oC trong 5 phút
- 94oC trong 1 phút
- 50oC trong 1 phút 35 chu kỳ - 72oC trong 1 phút
- 72oC trong 10 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lƣợng cDNA cho vào mỗi phản ứng thay đổi từ 2,5 – 5 µl. Sau khi thực hiện phản ứng PCR, ta sẽ thu đƣợc 25 µl sản phẩm (cDNA sợi đôi). Ta có thể thực hiện điện di ngay để xem kết quả hoặc cũng có thể trữ ở -20oC để chạy điện di sau.
Để kiểm tra sản phẩm RT-PCR có phải là đoạn gen mong muốn không ta thực hiện điện di trên gel agarose.
Nồng độ gel: 1,5% Hiệu điện thế: 50 V
Cƣờng độ dòng điện: 250 mA
Thời gian điện di: 45 phút (có thể canh vạch loading dye) Tỷ lệ mẫu : loading dye là 4 µl : 2 µl
Nhuộm ethidium bromide trong 20 phút Đọc kết quả trên máy chiếu tia UV.