ribosome của sán lá phổi Paragonimus
Nhiều loài sán lá có cấu trúc lặp tồn tại ở ITS-1 hoặc ITS-2 ảnh hưởng đến so sánh chuỗi [124, 132]. Các primer thiết kế trên những oligonucleotide có tính
bảo tồn cao được sử dụng cho tất các sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh, tạo phả hệ và di truyền. Ngoài ra nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh sinh vật [142]. So sánh gen và vùng giao gen với độ dài chuỗi nucleotide ở mức độ tin tưởng càng làm cho kết quả thu được chính xác hơn về góc độ thẩm định loài, phả hệ, quan hệ về loài và di truyền quần thể [130].
Hơn nữa, so sánh phân tích toàn bộ chuỗi gen, toàn bộ rTU có giá trị chính xác hơn so với so sánh chỉ một đoạn DNA của rTU. Xuất phát từ nhu cầu đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam đã thu được rTU gần/hoàn chỉnh của nhiều loài sán lá chứa đầy đủ gen 18S, 5.8S và 28S rRNA. Tuy vẫn còn nhiều loài chưa có rTU, ít nhất là phần mã hóa gồm 18S, ITS-1, 5.8S, ITS-2, 28S, nhưng số lượng giải mã rTU các loài sán dẹt ngày càng tăng, từ đó cho phép có thể trích xuất chỉ thị toàn phần các gen 18S và 28S để nghiên cứu so sánh loài và xây dựng phả hệ [133].
Bệnh KST do sán lá gây ra, trong đó có các bệnh sán lá phổi, tái xuất hiện ngày càng nhiều trên thế giới và ở Việt Nam. Hơn nữa, phần lớn các loài SLP, đặc biệt là các dạng ấu trùng có sự tương đồng cao về hình thái và sinh lý, đây là điểm khó khăn đặt ra cho yêu cầu cần thiết có công tác giám định, chẩn đoán sớm và chính xác loài SLP gây bệnh SLP trên thế giới và ở Việt Nam [1, 9, 25, 32]. Nghiên cứu đặc điểm gen của mtDNA và rTU, biến đổi di truyền và tiến hóa của các loài SLP là thực sự cần thiết nhằm tìm hiểu và phát hiện chỉ thị đặc trưng khắc phục nhược điểm của phương pháp truyền thống trong việc giám định HTH và phục vụ công tác chẩn đoán chính xác loài gây bệnh [133].
Đối với KST, hiểu biết đầy đủ về mtDNA/rTU còn có giá trị định hướng phòng chống, tìm kiếm hóa chất, hóa dược, hoặc thực nghiệm các loại vacxin thế hệ mới. Sán lá phổi họ Paragonimidae, trong đó đối tượng nghiên cứu của đề tài này là 2 loài chủ yếu gồm P. heterotremus và loài P. ohirai; và 3 loài kết hợp gồm P. iloktsuenensis, P. miyazakii và P. westermani, đang là tiêu điểm chú ý của y tế cộng đồng trên toàn thế giới. Hệ thống phân loại của chúng được xác định thuộc giống
Paragonimus, họ Paragonimidae (Phân bộ: Troglotremata; Lớp: Trematoda; Ngành: Platyhelminthes). Hình thái, cấu tạo, chu kỳ phát triển của SLP đại diện và phân bố toàn cầu của chúng cũng như điều tra tại Việt Nam đã được mô tả ở 13 tỉnh tại Việt Nam. Một số tỉnh được coi là điểm nóng của SLP trên người (loài P. heterotremus)
ở vùng Tây-Bắc, đó là Lai Châu, Yên Bái, tiếp theo là Điện Biên, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Hòa Bình [25].
Dữ liệu của mtDNA và rTU của Paragonimus spp. cũng chưa được thu nhận và phân tích đầy đủ hoặc giải quyết còn phiến diện trên thế giới trong đó có các loài SLP gây bệnh trên người và cả 7 loài phát hiện tại Việt Nam. Vì vậy, những nghiên cứu triệt để cần được tiến hành để phục vụ chẩn đoán nhanh, đơn giản và chính xác, kịp thời, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng đặc biệt làm sáng tỏ đặc điểm phân loại, đặc điểm gen của các loài SLP tại Việt Nam. Hệ gen ty thể và rTU của SLP nói riêng và của sán lá nói chung cần có thêm dữ liệu và đặc điểm gen học để cung cấp nguồn thông tin, chỉ thị giá trị cho xác định loài, chẩn đoán, phân biệt, phả hệ, tiến hóa và di truyền quần thể ngày càng được chính xác hơn [85, 86, 143–145].
Xuất phát từ những yêu cầu đó, nghiên cứu này được thực hiện với tên đề tài:
“Nghiên cứu hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và một số khu vưc ở châu Á”.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, mục tiêu, nội dung và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là sán lá phổi thuộc giống Paragonimus, họ Paragonimidae, trong đó đối tượng chính cho nghiên cứu toàn bộ hệ gen ty thể là hai loài: Paragonimus heterotremus và P. ohirai; và nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome ngoài P. heterotremus và P. ohirai còn có 3 loài là P. iloktsuenensis, P. miyazakii và loài P. westermani.
2.1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung là: “Thu được toàn bộ hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa
ribosome của một số loài sán lá phổi họ Paragonimidae tại Việt Nam và châu A, phân tích đặc điểm gen và hệ gen phục vụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử và ứng dụng trong chẩn đoán phân loại”.
Mục tiêu cụ thể là:
1. Thu được toàn bộ hệ gen ty thể của sán lá phổi loài Paragonimus heterotremus và loài Paragonimus ohirai, phân tích đặc điểm gen/hệ gen ty thể và phân tích xây dựng phả hệ.
2. Thu được toàn bộ đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá phổi châu A (Paragonimus heterotremus, Paragonimus ohirai, Paragonimus miyazakii, Paragonimus iloktsuenensis, Paragonimus westermani), phân tích đặc điểm gen và phân tích xây dựng phả hệ.
2.1.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1. Giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể của sán lá phổi loài
Paragonimus heterotremus và loài Paragonimus ohirai, phân tích đặc điểm gen/hệ
gen ty thể và phân tích xây dưng phả hệ.
- Giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể sán lá phổi loài P. heterotremus và loài
- Phân tích đặc điểm gen của hệ gen của ty thể, gồm cấu trúc bậc hai, phương thức sử dụng nucleotide, giá trị độ lệch (skew), sử dụng và thiên vị bộ mã và khoảng cách di truyền giữa một số loài trong họ Paragonimidae.
- Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu amino acid cộng hợp của 12 gen PCG.
Nội dung 2. Giải trình tự đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá phổi
châu Á (Paragonimus heterotremus, Paragonimus ohirai, Paragonimus miyazakii,
Paragonimus iloktsuenensis, Paragonimus westermani), phân tích đặc điểm gen và phân tích xây dưng phả hệ.
- Giải trình tự đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá phổi châu Á, xác định
cấu trúc và sắp xêp gen trong đơn vị mã hóa ribosome.
- Phân tích đặc điểm gen và vùng giao gen của đơn vị mã hóa ribosome của
P. heterotremus và P. ohirai, P. miyazakii, P. iloktsuenensis, P. westermani, gồm cấu trúc bậc hai, phương thức sử dụng nucleotide, giá trị độ lệch (skew) và mức độ tương đồng giữa một số loài trong họ Paragonimidae.
- Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu đơn gen 28S rRNA toàn phần và cộng hợp hai gen 18S+28S rRNA toàn phần.
Dựa vào kết quả công bố về hệ gen của mtDNA và rTU của nhiều loài sán dẹt và SLP hiện có, các gen và vùng giao gen của mtDNA và rTU thu được được xác định và phân tích. Hình 2.1 trình bày Sơ đồ nghiên cứu, trên các đối tượng gồm: i) Nghiên cứu hệ gen ty thể (mtDNA) của hai loài Paragonimus
heterotremus (Việt Nam); và loài P. ohirai (Nhật Bản);
ii) Nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome (rTU) của 5 loài/6 chủng: 1) P. heterotremus
(Việt Nam); 2) P. ohirai (Nhật Bản); 3) P. iloktsuenensis (Nhật Bản);
4) P. miyazakii (Nhật Bản); 5) P. westermani gồm 2n và 3n (Ấn Độ và Hàn Quốc) (Bảng 2.1).
Ở cả mtDNA và rTU, các chỉ tiêu phân tích bao gồm: cấu trúc, sắp xếp gen/hệ gen/vùng giao gen, thành phần/đặc điểm gen, vùng giao gen và các phân tích phả hệ. Ở mtDNA, có tính toán khoảng cách di truyền giữa các chủng/loài, ở rTU có phân tích cấu trúc bậc hai của một số gen giữa các chủng/loài. Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng cụ thể cho các chỉ tiêu nghiên cứu ở mỗi nội dung được mô tả ở các mục ở Chương 2; các thông tin, phương pháp và kỹ thuật, kết quả bổ cứu được
i nucleotide rTU i nucleotide mtDNA
i nh ư
18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S 12 PCG+2 MRG+22 tRNA+NCR
Xư ly i, chu i, c nh gen, ng giao gen u c p p a mtDNA va rTU
trình bày và mô tả ở Phần Phụ lục I. Các kết quả đạt được của mỗi chỉ tiêu và đánh giá kết quả được trình bày chi tiết theo trình tự hai nội dung nghiên cứu mtDNA và nghiên cứu rTU ở Chương 3 và Bàn luận ở Chương 4
u SLP thu p (HTH), i nghiên u
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nghiên cứu và các bước thực hiện hai nội dung chính: i) Nghiên cứu
hệ gen ty thể (mtDNA); ii) Nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome (rTU).
Ghi chú: SLP: sán lá phổi; HTH: hình thái học; SHPT: sinh học phân tử. PCG: gen mã hóa protein; MRG: gen ribosome ty thể; tRNA: RNA vận chuyển amino acid. Ký hiệu gen, vùng giao gen, sắp xếp gen được mô tả chi tiết trong các mục tương ứng trong luận án.
Đơn a ribosome (rTU)
( ng/ i: P. heterotremus; P. ohirai; P. iloktsuenensis; P. miyazakii; P. westermani) gen ty (mtDNA) (Paragonimus heterotremus P. ohirai) ch t DNA ng sô m nh ng c, m nh (SHPT)
t kê i (mtDNA; rTU)
PCR/LPCR/( ch ng) mtDNA u c/ p p gen nh n/ c m gen ng ch di n 3 PCG/12 PCG rTU u c/ p p gen nh n/ c m gen u c c hai a gen 18S/28S/18S+28S
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu này được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Thời gian thực hiện: 2017–2020.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Nguồn vật liệu là mẫu sán lá phổi nghiên cứu
Mẫu là SLP trưởng thành ở dạng tươi đông lạnh, hoặc trong cồn 70%, do các đối tác của Nhật Bản và Việt Nam cung cấp, sau đó được tách DNA tổng số tại Viện Công nghệ sinh học và được bảo quản ở –20oC cho đến khi sử dụng nghiên cứu. Bảng 2.1 thống kê các mẫu nghiên cứu, ký hiệu chủng và nguồn gốc xuất xử của mẫu sử dụng trong đề tài của luận án.
Bảng 2.1. Danh sách các loài và các chủng sán lá phổi châu Á Paragonimus spp. làm đối tượng
chính thực hiện giải trình tự và nghiên cứu hệ gen ty thể (mtDNA) và đơn vị mã hóa ribosome (rTU) của nghiên cứu này
Loài Xuất xứ Ky hiệu chủng* mtDNA rTU
1 Paragonimus heterotremus Việt Nam Phet-LC-VN √ √
2 Paragonimus ohirai Nhật Bản Pohi-Kino-JP √ √
3 Paragonimus iloktsuenensis Nhật Bản Pilo-Amami-JP √
4 Paragonimus miyazakii Nhật Bản Pmiy-OkuST1-JP √
5 Paragonimus westermani Ấn Độ Pwes-Megha(2n)-IN √
Hàn Quốc Pwes-Bogil(3n)-KR √
* Chủng LC của loài P. heterotremus (Việt Nam), ký hiệu Phet-LC-VN và chủng Kinosaki của loài P. ohirai
(Nhật Bản), ký hiệu Pohi-Kino-JP được giải trình tự toàn bộ mtDNA và rTU và phân tích đặc điểm gen/hệ gen. Những chủng/loài còn lại là đối tượng chính đề tài lựa chọn để giải trình tự rTU và phân tích đặc điểm gen.
Mẫu cung cấp là SLP trưởng thành thu được sau khi gây nhiễm động vật bằng metacercaria, cụ thể:
Mô tả tóm tắt gây nhiễm chuột bằng metacercariae thu SLP trưởng thành P. ohirai do đối tác Nhật Bản thực hiện: Chuột Albino (Rattus norvegicus), được gây nhiễm metacercariae thu từ vật chủ trung gian tự nhiên là cua Sesarma dehaani (gần đây được đổi tên thành Chiromantes dehaani) [30]. Cua được thu thập tại vùng Kinosaki (quận Hyogo, 35◦37'0"N, 134◦49'0"E) và vùng Nagoya (35◦10'0"N, 136◦55'0"E), Nhật Bản. Chuột đực từ 5–8 tuần tuổi được sử dụng để gây nhiễm metacercariae qua đường miệng bằng ống thông dạ dày. Chuột được nhốt trong lồng riêng và cho ăn chế độ ăn bình thường. Sán trưởng thành được thu thập hai tháng sau khi nhiễm bệnh. Chuột bị nhiễm bệnh được gây mê bằng ête và gây chảy
máu cho đến chết rồi mổ khám thu sán trưởng thành [146].
Mẫu SLP trưởng thành P. heterotremus thu được sau khi gây nhiễm chuột hoặc chó bằng metacercariae thu thập từ cua (vật chủ trung gian) bị nhiễm trong tự nhiên ở các vùng dịch tễ tại Việt Nam (P. heterotremus ở Sìn Hồ, Lai Châu) do đối tác Việt Nam (TS. Đăng Tất Thế, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) thực hiện và cung cấp. Các mẫu SLP trưởng thành ở Nhật Bản/Hàn Quốc/Ấn Độ do GS.TS Takeshi Agatsuma (Trường Đại học Y khoa Kochi, Nhật Bản) cung cấp bao gồm: P. ohirai ở các vùng Kinosaki và Nagoya, Nhật Bản; P. miyazakii ở vùng Okuyanai, Kochi, Nhật Bản; P. iloktsuenensis ở vùng Amami, Kagoshima, Nhật Bản; P. westermani (3n) ở vùng Bogil, Hàn Quốc; và P. westermani (2n) ở vùng Meghalaya, Ấn Độ.
Ngoài 6 chủng/5 loài SLP Paragonimus kể trên, một số chủng khác của 5 loài này trong họ Paragonimidae cũng được sử dụng để thu nhận một số chỉ thị mtDNA và rTU để thẩm định loài bằng SHPT, so sánh với các chủng quốc tế có trong Ngân hàng gen hoặc đã công bố trước đây cho nghiên cứu phân tích phả hệ và tiến hóa.
2.2.2. Vật liệu khuôn DNA và các loại mồi sử dụng
Vật liệu nghiên cứu chính là DNA tổng số tách chiết từ SLP trưởng thành của 6 chủng/5 loài Paragonimus thuộc đối tượng chính của nghiên cứu, sử dụng để thực hiện PCR/LPCR và giải trình tự thu nhận mtDNA và rTU.
Các mồi sử dụng cho PCR và giải trình tự toàn bộ mtDNA của P. heterotremus và của P. ohirai (Phụ lục I: Bảng PL2.1), bao gồm các mồi chung của sán lá lớp Trematoda từ các nghiên cứu trước đây [85, 86, 90, 105], các mồi chung của SLP giống Paragonimus và các mồi đặc hiệu riêng của từng loài được được thiết kế trong nghiên cứu này.
Các mồi sử dụng cho PCR và giải trình tự toàn bộ rTU của 6 chủng/5 loài
Paragonimus trong nghiên cứu này, bao gồm một số mồi chung của đơn vị mã hóa ribosome của sán lá Trematoda từ các nghiên cứu trước đây [2, 124, 132] và các mồi mới được thiết kế trong nghiên cứu này (Phụ lục I: Bảng PL2.4).
2.2.3. Hóa chất, sinh phẩm, dụng cụ
Các sinh phẩm chủ yếu từ Hãng Thermo Fisher Scientific Inc. (MA, USA), bao gồm DreamTaq PCR Master Mix (2×); Kit tách chiết DNA tổng số GeneJET™
Genomic DNA Purification Kit; Kit tinh sạch DNA GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit; Kit tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp GeneJET Plasmid Miniprep Kit. Kit tách dòng CloneJET PCR Cloning Kit (sản phẩm PCR ngắn) hoặc TOPO XL PCR Cloning Kit (sản phẩm PCR dài) từ Invitrogen Inc. (CA, USA). Các loại hóa chất như NaCl, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, CaCl2, Triton-X 100, DMSO, agarose, sucrose, glucose, trypton, glycerol, cồn ethanol tuyệt đối, nước khử ion DEPC, các loại kháng sinh kanamycin, ampicilin và các hóa chất thông dụng khác của các hãng Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, Merck, Sigma. Vật tư, hóa chất, dụng cụ thuộc loại tinh khiết, chất lượng tốt được đặt hàng theo yêu cầu của các đề tài NAFOSTED (mã số: 108.02- 2017.09 và 108.02-2020.07).
2.2.4. Trang thiêt bị
Máy đo quang phổ định lượng DNA Thermo Scientific Nanodrop 1000 UV/VIS spectrophotometer hoặc GBC UV/visible 911A spectrophotometer (GBC Scientific Equipment Pty. Ltd., Australia); máy PCR PTC-100 (Appied Biosystem, Mỹ) và máy PCR Eppendorf (Đức); bộ điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA dưới tia UV gắn máy ảnh (Wealtec, Sparks, NV, USA); dụng cụ Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm Eppendorf. Ngoài ra cơ sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ có tại Viện Công nghệ sinh học (https://www.ibt.ac.vn/ ) đều hiện đại, đầy đủ cho nghiên cứu SHPT gen/hệ gen, bố trí tại Phòng Thí nghiệm của Phòng Miễn dịch học và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen.
2.3. Phương pháp nghiên cứu gen và hệ gen ty thể (mtDNA)
Các phương pháp kỹ thuật thường qui của nghiên cứu SHPT sử dụng trong nghiên cứu mtDNA và rTU trong đề tài này được giới thiệu và mô tả từng bước thực hiện ở Phần Phụ lục II, bao gồm:
+ PL2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
+ PL2.2. Phương pháp thiết kế mồi chung và mồi đặc hiệu mtDNA + PL2.3. Phương pháp thiết kế mồi giải trình tự rTU
+ PL2.4. Thành phần phản ứng, thực hiện PCR và kiểm tra sản phẩm + PL2.5. Phương pháp thu nhận DNA ribosome các loài sán lá phổi + PL2.6. Phương pháp tách dòng, thu DNA plasmid tái tổ hợp