Không xếp loại C-C Conopressin Contryphans Vasopressin Kênh Ca2+ kiểu L Lys-cono- pressin-G Am975 C.geographus C.amadis Tuyến tính Không có cystein O-linked Conantokins Conorfamide Contulakin Glutamate(NM DA) RF amide Neurotensin Pr1 CNF-Sr2 Contulakin C.parius C.spurius C.geographus Ị2.2.4. Ứng dụng y học của độc tố ốc cối
Tùy thuộc vào khả năng gây tử vong, mỗi loại peptide của độc tố ốc thuộc loại conotoxin (gây tử vong) hoặc conopeptide (không gây tử vong). Mỗi loại độc tố ốc là một dãy duy nhất chứa trên 100 loại peptide khác nhaụ Khi giải mã gen, người ta thấy rằng các conotoxin là các propeptide, sau đó chúng được enzym endoprotease phân cắt để tạo thành các peptide độc cuối cùng. Các peptide này có kích thước nhỏ, tương đối dễ tổng hợp, cấu trúc ổn định, tác dụng vào các mục tiêu
chuyên biệt làm cho chúng trở thành các đầu dò (probe) lý tưởng trong dược học. Một điều rất ngạc nhiên là đa số các độc tố ốc có liên quan sự giảm đau đớn và được dùng trong trị liệu giảm đaụ Người ta ước lượng có khoảng trên 50.000 đến 100.000 loại conopeptide nhưng chỉ mới khoảng 0,1% được đặc trưng hóa về dược học. Chính nguồn độc tố lớn lao này là một nguồn vật liệu dồi dào cho việc nghiên cứu đặc tính và ứng dụng.
Việc nghiên cứu độc tố ốc cối đã được tiến hành trên sáu thập niên, qua đó đã phát hiện và tìm ra các peptide có dược tính giảm đaụ Hiện nay mới chỉ có trên 1000 chuỗi peptide được định danh và xác định được tính chất ức chế các kênh ion của chúng. So với nguồn từ trên 50.000 cho đến 100.000 loại peptide trong độc tố ốc cối, đây mới chỉ là con số nhỏ bé.
Hiện nay, có 6 peptide khác nhau của ốc cối đã được thử nghiệm lâm sàng trên ngườị Một bước tiến quan trọng là việc sử dụng các đoạn peptide của ốc cối để làm thuốc giảm đau đã được chấp nhận bởi Viện Vệ Sinh và An Toàn Thực Phẩm vào tháng 12 năm 2004 (Olivera, 2006). Sản phẩm thương mại Prialt (gọi chung là ziconitite) được bào chế từ các đoạn peptide tự nhiên, chủ yếu là từ loài Conus magus, và được thiết kế một cách độc đáo từ họ peptide ω-conotoxin MVIIẠ Đây là một trong những lớp peptide được tchs chiết từ độc tố của loài ốc cối ăn cá (tác dụng lên kênh Ca2+ ). Một loại peptide khác, cũng hoạt động theo cơ chế như trên, là ω-conotoxin GVIA từ Conus geographus cũng được ứng dụng rộng rãi trong khoa học thần kinh, với khoảng hơn 2000 nghiên cứu sử dụng thành phần này trong nghiên cứu dược lý học (Terlau và Olivera, 2004). Những ứng dụng y học của các peptide độc tố được trình bày ở bảng 1.3:
Bảng 1.3: Các peptide độc tố với những liệu pháp tiềm năng
Ị3. TỔNG QUAN VỀ TY THỂ VÀ DNA TY THỂ
Ty thể (Hình 1.10)
Hình 1.10: Cấu trúc của ty thể (www.nangluongsinhhoc2011.blogspot.com) Ty thể được phát hiện và mô tả đầu tiên bởi Altman từ năm 1894 và đến năm 1897 Benda đặt tên là mitochondriạ Cấu trúc siêu hiển vi của ty thể được Palad nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử vào năm 1952 và Sjostand vào năm 1953.
Các động vật có cấu trúc phức tạp, bao gồm cả con người, đều cần một lượng lớn năng lượng mới có thể tồn tại được Ty thể là những bào quan phổ biến trong các tế bào nhân chuẩn có lớp màng kép và hệ gene riêng. Chúng có thể được coi là những nhà máy sản xuất năng lượng của tế bàọ Tại đây xảy ra quá trình hô hấp tế bào chuyển ôxy và chất dinh dưỡng thành adenosine triphosphate (ATP).
- Hình dạng và thành phần hóa học của ty thể
Ty thể là những bào quan nhỏ vùi trong tế bào chất đường kính 1-10 micromet. Số lượng thay đổi tùy thuộc từng loại tế bàọ Ví dụ: tế bào gan động vật thường chứa khoảng 1000 - 2000 ti thể, phân bố tương đối đều, chiếm 1/5 thể tích tế bàọ
Ty thể có đường kính trung bình 0.5-1µm, thường có dạng hình thoi hoăc bầu dục. Có thể tròn (ở những tế bào cần ít năng lương) hoặc dài (ở tế bào có hoạt động mạnh). Có thể phân tán đều trong tế bào chất, có thể tập trung ở một số vùng nhất định: tế bào ruột-ở gân lông nhung, tế bào tinh trùng-quanh đoạn giữạ
Trong ty thể có các thành phần : C, H, O, N, S, P và một số nguyên tố vi lượng. Các ion Ca, Ma cũng có trong Ty thể với số lượng nhỏ. Các đại phân tử gồm có prôtêin chiếm tỉ lệ 30-40%, lipit 25-30%, các loại axit nucleic 1%. Trong ty thể có tập hợp các hệ enzim xúc tác quá trình oxy hóa-khử và trao đổi năng lượng. Ngoài ra trong ty thể đáng chú ý là ADN ty thể và ribôxom.
- Cấu trúc của ty thể
Ty thể được cấu tạo bởi hai lớp màng, các màng này đóng vai trò quyết định trong hoạt động chuyển hoá năng lượng. Từ trong ra ngoài cấu trúc của ty thể bao gồm: khoang chất nền, màng trong, khoang gian màng và cuối cùng là màng ngoàị Chất nền là khoảng chiếm bên trong cùng của ty thể.
+ Màng ngoài trơn nhẵn, ngăn cách ty thể với tế bào chất.
+ Màng trong bao quanh xoang trống của ty thể và hình thành nên các tấm răng lược ( mào), chúng ngăn ty thể thành 2 xoang là xoang trong và xoang ngoài nhưng vẫn lưu thông với nhaụ
+ Trên mào chứa enzim hô hấp.
+ Chất nền có chứa ADN và Ribôxôm.
- Chức năng của ty thể
+ Là trạm chuyển hoá năng lượng từ chất dinh dưỡng thành năng lượng tích trữ dưới dạng ATP. Mào chứa nhiều enzim hô hấp có vai trò quan trọng trong việc biến đổi năng lượng dự trữ trong các nguyên liệu hô hấp( glucose) thành năng lượng ATP cho tế bàọ
+ Tham gia quá trình di truyền qua tế bào chất
+ Sản xuất một số hợp chất hữu cơ. Có khả năng tự tổng hợp 1 số loại Prôtêin (các enzim ôxi hoá).
+ Tạo ra nhiều sản phẩm trung gian có vai trò trong quá trình chuyển hoá vật chất. Hệ gen ti thể (Mitochondrial DNA – mtDNA) (Hình 1.11)
DNA ty thể (mitochondrial DNA- mtDNA) là một genome độc lập, thường là mạch vòng, được định vị trong ty thể. Bộ gen ty thể có cấu tạo xoắn kép, trần, mạch vòng với 2 chức năng chủ yếu:
- Mã hóa nhiều thành phần của ty thể.
- Mã hóa cho một số protein tham gia vào chuỗi chuyền điện tử.
Hình 1.11: DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein. Mũi tên đỏ chỉ gen CO1.
DNA ty thể của tế bào động vật mã hóa đặc trưng cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNẠ DNA ty thể của nấm men Saccharomyces. cerevisiae dài hơn mtDNA của tế bào động vật năm lần do sự có mặt của các đoạn intron dàị
Các genome ty thể có kích thước tổng số rất khác nhau, các tế bào động vật có kích thước genome nhỏ (khoảng 16,5 kb ở động vật có vú). Có khoảng một vài trăm ty thể trên một tế bàọ Mỗi ty thể có nhiều bản sao DNẠ Số lượng tổng số của DNA ty thể so với DNA nhân là rất nhỏ (<1%).
Trong nấm men Saccharomyces cerevisiae, genome ty thể có kích thước khá lớn (khoảng 80 kb) và khác nhau tùy thuộc vào từng chủng. Có khoảng 22 ty thể trên một tế bào, tương ứng khoảng 4 genome trên một cơ quan tử. Ở những tế bào sinh trưởng, tỷ lệ mtDNA có thể cao hơn (khoảng 18%).
Kích thước của genome ty thể ở các loài thực vật là rất khác nhau, tối thiểu khoảng 100 kb. Kích thước lớn của genome đã gây khó khăn cho việc phân lập nguyên vẹn DNA, nhưng bản đồ cắt hạn chế (restriction map) trong một vài loài thực vật đã cho thấy genome ty thể thường là một chuỗi đơn, được cấu tạo như một mạch vòng. Trong mạch vòng này có những chuỗi tương đồng ngắn và sự tái tổ hợp giữa chúng đã sinh ra các phân tử tiểu genome (subgenome) mạch vòng nhỏ hơn, cùng tồn tại với genome “chủ” (master genome) hoàn chỉnh, đã giải thích cho sự phức tạp của các DNA ty thể ở thực vật.
Bảng 1.4 tóm tắt sự phân công của các gen trong một số genome ty thể. Tổng số gen mã hóa protein là khá ít, và không tương quan với kích thước của genomẹ Ty thể động vật có vú sử dụng các genome 16 kb của chúng để mã hóa cho 13 protein, trong khi đó ty thể nấm men S. cerevisiae dùng các genome từ 60-80 kb mã hóa cho khoảng 8 protein. Thực vật với genome ty thể lớn hơn nhiều mã hóa cho nhiều protein hơn. Các intron được tìm thấy trong hầu hết các genome của ty thể, nhưng lại không có trong các genome rất nhỏ của động vật có vú.
Bảng 1.4: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA
Hai rRNA chính luôn được mã hóa bởi genome ty thể. Số lượng các tRNA được mã hóa bởi genome ty thể dao động từ không cho đến đầy đủ (25-26 trong ty thể). Nhiều protein ribosome được mã hóa trong genome ty thể của thực vật và sinh vật nguyên sinh, nhưng chỉ có một ít hoặc không có trong genome của nấm và động vật.
Ti thể di truyền theo dòng mẹ. Hệ gen ti thể có số lượng gen ít hơn hệ gen nhân, ko có hiện tượng trao đổi chéo, các thay đổi chủ yếu do đột biến nên dựa vào tốc độ thay đổi nucleotide có thể xác định thời gian tiến hóa, xác lập đồng hồ phân tử.
Cấu trúc gen ty thể của ốc cối Conus textile (Hình 1.12)
Năm 2008, trình tự DNA ty thể của Conus textile đã được giải mã hoàn toàn có chiều dài 15.562 nucleotide và có cấu trúc tương tự như DNA ty thể loài ốc
Lophiotoma cerithiformis. Hệ gen ty thể Conus textile là một phân tử DNA dạng vòng, có chiều dài 15562 nucleotide, mã hóa cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNẠ Trong đó, các gen mã hóa protein ty thể bao gồm: các gen coxI-III mã hóa cho cytochrome oxidase 1-3; các gen atp6 và atp8 mã hóa cho các tiểu đơn vị 6 và 8 của ATPase; các gen nad1-6 và nad 4L mã hóa cho các tiểu đơn vị 1-6 và 4L của NADH dehydrogenase; gen cob mã hóa cho cytochrome b. Các gen khác bao gồm 2 gen mã hóa rRNA (gen rrnS mã hóa 12S rRNA và gen rrnL mã hóa cho 16S rRNA) và 22 gen mã hóa các tRNẠ Hai tiểu đơn vị lớn và nhỏ của rRNA được sao chép từ cùng một sợi trong khi các tRNA cho M, Y, C, W, H, G, E, và T được sao chép từ các sợi bổ sung. (Bandyopadhyay và cs, 2008).
Hình 1.12: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile. Mũi tên ký hiệu gen CO1.
Ứng dụng chỉ thị CO1 mtDNĂCytochrome oxidase subunit 1) trong nghiên cứu di truyền:
CO1 (cytochrome c oxidase subunit 1) là một protein được tìm thấy trong ty thể. CO1 chỉ di truyền qua hệ mẹ, nó thường được sử dụng trong mã hóa trình tự DNA của các loài vì tần số đột biến của nó thường đủ nhanh để phân biệt mối quan hệ chặt chẽ giữa các loàị Ngoài ra CO1 còn có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu di truyền như định danh loài và nghiên cứu mối quan hệ tiến hóạ
Folmer và cs (1994) thiết kế cặp mồi của chuỗi phản ứng (PCR) khuếch đại đoạn 710bp của gen CO1 mt DNA từ 11 ngành động vật không xương sống: Echinodermata, Mollusca, Annelida, Pogonophora, Arthropoda, Nemertinea, Echiura, Sipuncula, Platyhelminthes, Tardigrada, and Coelenteratạ Mục tiêu của nghiên cứu là phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài của các loài sinh vật. Nhóm tác giả tập trung vào gen CO1 vì nó xuất hiện bảo thủ trong số các gen mã hóa protein trong bộ gen ty thể của động vật và được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu tiến hóa về saụ
Bandyopadhyay và cs (2008) đã hoàn thành giải trình tự DNA ty thể của loài
dài hơn 165bp, điều này có ý nghĩa quan trọng trong phân tích mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Conus với nhau và đặc biệt có ý nghĩa trong việc xây dựng mô hình tiến hóa giữa các loài trong tổng họ Conoideạ
Duda và Rolan (2005) sử dụng gen CO1 mtDNA của 90 loài ốc cối trong đó có 30 loài đặc hữu ở quần đảo Cape Verde để khảo sát mối quan hệ tiến hóa và xác định nguồn gốc các loài ốc cối ở Cape Verde . Kết quả cho thấy các loài này được phân làm 2 nhóm riêng biệt và thể hiện quần đàn đặc trưng cho vùng địa lý rất hẹp nàỵ
Duda và cs (2008) đã sử dụng các chỉ thị phân tử của DNA ty thể (16S rRNA và CO1) và một chỉ thị phân tử của DNA nhân để kiểm chứng phân loại một số loài ốc trong giống Conus (Conus sponsalis, Conus nanus, Conus ceylanensis, Conus musicus và Conus parvatus) tại khu vự miền tây Ấn Độ - Thái Bình Dương và
Conus nux ở khu vực đông Thái Bình Dương. Kết quả trong sự phân tích phát sinh của Conus nanus và Conus sponsalis cho thấy sự tiến hóa khác biệt, hoàn toàn phù hợp với hình thái khác nhau của chúng, và cũng đã xác định được một vài loài cận giống mà mức độ loài tiến hóa khác nhaụ
Ị4.CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN ỐC CỐI (CONUS SPP.) Ị4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Ị4.1.1. Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loài của ốc cối
Việc phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài dựa trên các đặc điểm hình thái giải phẫu (mà chủ yếu là kích thước, màu sắc, hoa văn vỏ, cấu tạo của hệ thống tiêu hóa, …) đôi khi mang lại kết quả không chính xác, đặc biệt là đối với các loài có quan hệ gần gũi và do vậy có nhiều đặc điểm hình thái giải phẫu giống nhaụ Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài và xác định một cách chính xác quan hệ phát sinh chủng loại loài là điều rất cần thiết.Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể dựa trên phân tích trình tự một gen hoặc một họ gen. Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể mở rộng hơn, chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc nhiều vùng DNA khác nhaụ
Với những loài có quan hệ gần, các gen hay vùng DNA có độ linh động cao (như intron, các vùng liên gen - đoạn chèn) thường hay được sử dụng. Song với các
loài có quan hệ xa thì các gen hay vùng DNA có độ bảo thủ cao như gen mã hóa các rRNA hay một protein ty thể hoặc nhân thường được sử dụng. Để tăng độ tin cậy, các nghiên cứu hiện nay thường sử dụng kết hợp cả hai (vùng DNA có độ bảo thủ với vùng DNA có độ biến thiên cao). Hơn thế nữa, các chỉ thị ty thể cũng thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân. Đối với các động vật thân mềm, DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loàị Các chỉ thị (marker) của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, cytochrome b, cytochrome oxydase, tRNA, và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và cs, 2008; Michael và Robert, 2005). Sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể sẽ giúp nâng cao độ phân giải và ý nghĩa thống kê so với việc sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ. Gen 16S rRNA mang đặc điểm cấu trúc cơ bản, có mặt ở khắp nơi và có đặc tính tiến hóa, bởi vậy nó trở thành marker phổ biến nhất trong sinh học phân tử.
Tuy nhiên, cho tới nay, mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài thuộc giống ốc cối vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để do các chỉ thị phân tử của DNA ty thể tỏ ra ít tin cậy khi được áp dụng để xác định vị trí phân loại của các loài mới tách ra (Espiritu và cs, 2002; Duda và cs, 2001; Duda và Kohn, 2005). Vì vậy, trong các nghiên cứu gần đây, các chỉ thị phân tử của DNA ty thể thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị phân tử của DNA nhân có tốc độ tiến hóa thấp hơn và trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn. (Duda & Palumbi, 1999; Cunha và cs, 2005; Duda và Kohn, 2005; Bandyopadhyay và cs, 2008; Nam