3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phân lập và xác định công thức cấu tạo chất sạch
Trong các cao chiết thu nhận đƣợc khi chiết với các dung môi n-hexane, dichloromethane, chlorofom, ethyl acetate, diethyl ether, buthanol, methanol. Thông thƣờng các thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane dễ phân lập để tách ra khỏi nhau hơn. Điều này có thể là do các cấu tử trong dịch chiết này ít phân cực nên quá trình phân lập bằng sắc ký cột thì các chất dễ tách ra khỏi nhau. Vì vậy chúng tôi chọn mẫu cao chiết trong n-hexane làm mẫu nghiên cứu chi tiết trong khóa luận tốt nghiệp này.
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
Thân và rễ cây Ngò ôm
Xử lý sơ bộ: làm sạch, phơi khô, nghiền. Mẫu bột nguyên liệu
Ngâm với methanol (3 lần) Lọc
Dịch chiết methanol Cô đuổi dung môi Cao methanol
Phân tán vào nƣớc.
Chiết lỏng-lỏng với n-hexane
Dịch chiết n-hexane Dịch nƣớc
Cô đuổi dung môi
Cao A GC-MS Phân lập Định danh A Chất sạch 1H-NMR 13C-NMR CTCT Dung môi Dịch chiết Bã
Cô đuổi dung môi Cao B
GC-MS
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các chất từ cao n-hexan
Để phân lập và tinh chế chất chúng tôi sử dụng:
- Sắc kí bản mỏng TLC Silicagel 60 F254 hãng Merck, dày 0.25 mm tráng trên nền nhôm.
- Silicagel nhồi cột là silicagel Merck cỡ hạt 0.04 - 0.06 mm.
- Cột sắc kí là ống thủy tinh có kích thƣớc 2 cm x 80 cm, bên dƣới có van khóa. - Thuốc thử phun lên bản mỏng sử dụng vanilin 1% trong dung dịch methanol H2SO4 đặc, sau đó sấy bản mỏng ở nhiệt độ khoảng 1100C.
a. Chuẩn bị thuốc thử
Lấy vào bình tam giác 200 mL MeOH, thêm 25 mL CH3COOH, làm lạnh hỗn hợp. Sau đó, thêm từ từ 11 mL H2SO4 đậm đặc.Cân 1.2 g vanilin. Cho từ từ từng lƣợng nhỏ vanilin vào hỗn hợp trên, vừa dùng đũa thủy tinh khuấy đều.
b. Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel dựa vào sắc kí bản mỏng với các bƣớc sau:
- Hoà tan hoàn toàn một lƣợng nhỏ mẫu trong dung môi CHCl3.
- Chuẩn bị 5 tấm bản mỏng rồi dùng ống mao quản chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.
Chạy cột đảo pha H2O: MeOH = 6:4 Chạy cột silicagen các hệ
dung môi đƣợc lựa chọn
CHCl3 : CH3OH : H2O = 200 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 175 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 150 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 125 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 100 : 25 : 1 A m =275 mg B m = 390mg C m =295 mg D m = 110mg E m = 315mg B1 m = 10mg Cao tổng n-hexane m= 9.185 gam
- Mỗi bản mỏng đƣợc chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau: CHCl3:CH3OH:H2O (với các tỉ lệ 200:25:1, 175:25:1, 150:25:1, 125:25:1, 100:25:1), CHCl3:MeOH (99:1), CHCl3:CH3COCH3 (8:2). Tiếp theo hiện hình bằng thuốc thử. Bản mỏng nào có sự tách vệt rõ ràng, các vệt nằm trong khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài bản mỏng thì hệ dung môi tƣơng ứng đó là thích hợp để chạy cột sắc kí.
Sau khi thử nghiệm chấm bản mỏng với cáchệ dung môi khác nhau, chúng tôi đã tìm thấy hệ dung môi phù hợp là CHCl3:CH3OH:H2O.
c. Chuẩn bị cột sắc kí
Cố định cột trên giá. Cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng [2].
Để việc tách chất đƣợc tốt, silicagel phải đƣợc nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Silicagel đƣợc nhồi vào cột sắc kí theo phƣơng pháp nhồi sệt [2].
Cho hệ dung môi n–hexan vào cốc thủy tinh (lựa chọn dựa vào sắc kí bản mỏng). Các hệ dung môi đã dùng trong quá trình chạy cột:
CHCl3 : CH3OH : H2O = 200 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 175 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 150 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 125 : 25 : 1 CHCl3 : CH3OH : H2O = 100 : 25 : 1
Lấy 150 gam silicagel cho từ từ từng lƣợng nhỏ vào cốc đựng hệ dung môi trên vừa khuấy đều để đuổi hết bọt khí, thu đƣợc một hỗn hợp sệt đồng nhất để nhồi vào cột sắc kí.
Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc dùng để rót trở lại đầu cột). Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lƣợng, vừa rót vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột đƣợc đồng nhất. Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột. Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng.
d. Nạp mẫu vào cột
Mẫu đƣợc nạp vào cột theo phƣơng pháp khô.
9.185g cao n-hexane hòa tan vừa đủ bằng CHCl3 trong bình cầu, thêm 5 gam silicagel, quay cất đến khô để chất gắn đều lên silicagel. Làm tơi mịn phần silicagel đã gắn mẫu bằng cối và chày sứ để nạp vào cột sắc kí.
Mẫu khô đã đƣợc làm tơi mịn đƣợc cho vào cột sắc kí từ từ thông qua phễu sau khi đã khoá cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phƣơng pháp khô thì lƣợng dung môi phải vừa đủ, không nhiều quá; lƣợng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt
silicagel trong cột; mẫu phải thấm ƣớt đều dung môi, không có bọt khí. Cho từng lƣợng nhỏ dung môi chạy cột vào rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột
e. Chạy cột đảo pha Chuẩn bị cột [2]
- Cố định cột trên giá sao cho thẳng đứng.
- Rửa cột bằng dung môi MeOH. Chú ý cần mở khóa hết cỡ để dung môi chảy mạnh liên tục.
- Khóa lại, đổ dầy dung môi vào cột, bịt kín đầu trên cột và để cột ổn định trong 1 khoảng thời gian (thƣờng là 6-8 giờ).
Đƣa chất lên cột
- Hòa tan mẫu bằng hệ dung môi phân cực: H2O: MeOH=6:4. Mở khóa để dung môi thoát ra đến đúng mặt silicagen thì khóa lại.
- Đƣa chất lên cột bằng pipet, chú ý cho chất chảy từ từ theo thành ống tránh việc làm mất độ phẳng rắn của mặt cột.
Chạy cột [2]
- Mở khóa cho dung môi chảy xuống đến sát mặt rắn silicagen thì khóa lại, thêm dung môi đến đầy cột, mở khóa cho tốc độ chảy vừa phải.
- Trong quá trình vừa hứng vừa chấm thử bản mỏng để xem chất ra khi nào.
- Thu dịch rửa dải vào ống nghiệm tới dung tích 8-10 mL thì thay ống nghiệm khác. Lọc qua silicagen hệ H:M = 6:4 thu đƣợc chất sạch B1