-Kỹ thuật xác định chủng VKĐR sinh ESBL: Các mẫu sau khi thu thập tại điểm nghiên cứu được vận chuyển, bảo quản và xử lý theo đúng quy trình sẽ tiến hành nuôi cấy trên thạch ChromID ESBL (Bio-Merieux-Pháp); ủ ở 370C trong vòng 18 đến 24 giờ thì ghi nhận kết quả theo hướng dẫn của nhà
sản xuất. Các khuẩn lạc có màu tím được xác định là chủng VKĐR sinh ESBL và được lựa chọn cấy sang môi trường thạch dinh dưỡng để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo. Kỹ thuật này được làm tại Phòng xét nghiệm Kháng kháng sinh của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và do các cán bộ tại đây triển khai.
-Định danh chủng VKĐR: VKĐR sinh ESBL được định danh bằng máy định danh Maldi - top của Hoa Kỳ sản xuất.
- Kỹ thuật xác định chủng VKĐR sinh ESBL mang gen mã hóa: Lấy các chủng VKĐR sinh ESBL nuôi cấy trong môi trường Luria-Bertani (của hãng
Invitrogen, Mỹ) ở nhiệt độ 37oC qua đêm, ly tâm thu cặn và hòa tan trong 200µl nước cất vô trùng, ủ ở 95oC trong 10 phút. Tiếp tục ly tâm, thu nước nổi để làm khuôn mẫu ADN. Phát hiện các gen mã hóa ESBL bằng kỹ thuật PCR đa mồi sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu.
Bảng 2.3. Các cặp mồi phát hiện gen mã hóa ESBL
TT Tên Trình tự mồi Kích thước (bp)
Tem-F TTTTCGTGTCGCCCTTATTCC 1 798 Tem-R CGTTCATCCATAGTTGCCTG ACTC 2 SHV-F TTATCTCCCTGTTAGCCACC 650 SHV-R GATTTGCTGATTTCGTCGG OXA-F GGCACCAGATTCAACTTTCA AG 3 564 OXA-R GACCCCAAGTTTCCTGTAAG TG 4 CTX-M F CGATGTGCAGTACCAGTAA 585 CTX-M R TTAGTGACCAGAATCAGCGG
- Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC): Được tiến hành theo quy trình xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Sáu loại kháng sinh được sử dụng bao gồm: ampicilin (AM), ceftazidim (CAZ), cefuraxim (CXM), cephalothin (CF), ciprofloxacin (CIP) và imipenem (IMP) để xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế VKĐR sinh ESBL và sử dụng chủng chuẩn là chủng E. coli ATCC 25922. Xác định tính KKS của VK theo tiêu chuẩn CLSI, 2014 [75].
- Kỹ thuật điện di xung trường (Pulsed-Field Gel Electrophoresis - PFGE) để tìm hiểu mối liên hệ kiểu gen [156][157]: Các chủng vi khuẩn đường ruột sinh ESBL mang gen CTX-M được đem tách chiết ADN trong thạch đệm sau đó chạy điện di sử dụng bộ điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif). Kết quả PFGE được phân tích bằng phần mềm Bionumerics 6.6.11 (Applied Maths) để tạo cây phả hệ giữa các chủng nghiên cứu nhằm xác định mối liên hệ hoặc khả năng lan truyền của các chủng này. Các chủng có độ tương đồng > 80% sẽ được xếp cùng vào một nhóm genotype.
Tất cả các kỹ thuật xét nghiệm trên được triển khai tại các phòng xét nghiệm của Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương và do các cán bộ tại đây thực hiện.