4. Những đóng góp mới của luận án
2.3.5Chuyển gen tạo cây đậu tương mang cấu trúc CRISPR/Cas9
Phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
được thực hiện dựa trên quy trình chuẩn tại phòng Công nghệ tế bào thực vật Viện Công nghệ sinh học (2020) [90] với các môi trường sử dụng trong thí nghiệm (Bảng 2.2) và bước thực hiện cơ bản như sau:
Bảng 2.2 Thành phần các môi trường sử dụng trong chuyển gen cây đậu tương
Tên môi trường
Thành phần pH
GCM (gieo hạt)
Muối đa lượng MS (10X) 100ml + muối vi lượng MS (100X) 10ml + Fe-NaEDTA (100X) 10ml + sucrose 20g/l + Agar 7 g/l
5,6
YEP lỏng (nuôi huyền phù khuẩn)
L-triptone or peptone 10g/l + Yeast Extract 10g/l + NaCl 5g/l (Nếu là môi trường đặc bổ sung Bacto agar 12 g/l)
7,0 - CCM lỏng (hòa khuẩn dùng biến nạp) - CCM đặc (đồng nuôi cấy)
Muối đa lượng B5 (10X) 10ml + Muối vi lượng B5 (100X) 1ml + Fe-NaEDTA (100X) 1ml + MES (20Mm) 3,9 g/l + sucrose 30g/l + Acetosyringone 0,04g/l + Viatmin B5 (100X) 10ml + GA3 (1mg/ml) 0,25ml + BAP (1,7mg/ml) 1ml + L-cystein 0,4g/l + Dithiothreitol (DTT) 0,154g/l + Na2SiO3 0,158g/l
(Nếu là môi trường đặc bổ sung Agar 5g/l)
5,4
- SIM lỏng (diệt khuẩn)
- SIM đặc (tạo đa chồi)
Muối đa lượng B5 (10X) 100ml + muối vi lượng B5 (100X) 10ml + Fe-NaEDTA (100X) 10ml + MES (3 Mm) 0,6g/l + sucrose 30g/l + Viatmin B5 (100X) 10ml + BAP (1,7mg/ml) 1ml + Timetin 50mg/l + Glufosinate 5mg/l
(Nếu là môi trường đặc bổ sung Phytagel 3g/l)
5,7
SEM
(môi trường kéo dài chồi)
Muối đa lượng B5 (10X) 100ml + muối vi lượng B5 (100X) 10ml + Fe-NaEDTA (100X) 10ml + MES (3 Mm) 0,6g/l + sucrose 30g/l + Viatmin B5 (100X) 10ml + GA3 (1mg/ml) 0,5ml + Timetin 50mg/l + Cefotaxime 100 mg/l + IAA (1mg/ml) 100 microlit + Zeatin-R (1mg/ml) 1ml + Glufosinate 2 mg/l
RM (tạo rễ) Muối đa lượng MS (10X) 100ml + muối vi lượng MS (100X) 10ml + Fe-NaEDTA (100X) 10ml + MES (3 Mm) 0,6g/l + sucrose 20g/l + Viatmin B5 (100X) 10ml + BAP (1,7 mg/ml) 1ml + Timetin 50 mg/l + Asp/Glu (stock 5 mg/ml) 10ml + Cefotaxime 100 mg/l + Vancomycin 50 mg/l + Phytagel 3g/l
- Tạo nguyên liệu chuyển gen: hạt đậu tương chín sau khi được khử trùng, nảy mầm 3 ngày trên môi trường GCM, tách, thu phần lá mầm (tương tự như tạo nguyên liệu nuôi cấy rễ tơ in vitro ) và gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7 - 8 lần vào phần nốt lá mầm. Lá mầm đã được làm tổn thương sẽ dùng cho bước nhiễm khuẩn tiếp theo.
-Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens
Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: cấy trải chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 mang cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 từ ống giữ chủng lên môi trường YEP đặc, có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi trong tủ ổn nhiệt 28oC trong thời gian 48 giờ.
Nuôi lỏng khuẩn: dùng que cấy chọn một khuẩn lạc riêng biệt trên đĩa khuẩn cấy vào môi trường YEP lỏng bổ sung các loại kháng sinh như nuôi đặc. Bình nuôi lỏng được lắc 200 v/p ở 28oC trong 16 giờ ở điều kiện tối hoàn toàn trên máy lắc. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: dịch khuẩn thu từ quá trình nuôi lỏng được hòa loãng 2 - 3 lần và tiếp tục nuôi phục hồi 2 - 4 giờ. Sau đó dịch khuẩn được ly tâm ở 5000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Loại bỏ phần dịch nổi và hòa tan cặn khuẩn trong môi trường CCM lỏng có bổ sung AS và pha loãng cho đến khi dịch khuẩn có OD660 đạt 0,8 - 1. Dịch huyền phù này được dùng cho biến nạp.
- Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Môi trường đồng nuôi cấy là CCM đặc có bổ sung AS. CCM được đổ trên đĩa petri, khi khô đặt giấy thấm đã khử trùng lên trên bề mặt môi trường. Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong thời gian là 5 ngày.
- Diệt khuẩn và tạo đa chồi
Mẫu biến nạp sau thời gian đồng nuôi cấy được lắc trong môi trường SIM lỏng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Dùng panh và dao cắt bỏ chồi chính xuất hiện trên các mảnh lá mầm, cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxime. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime, 3 mg/l PPT và nuôi trong 2 tuần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tái sinh cây hoàn chỉnh
trường phát triển chồi SEM có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 3 mg/l PPT. Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 5 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ RM có bổ sung 250 mg/l cefotaxime để tạo cây hoàn chỉnh.
- Kiểm tra tính kháng thuốc trừ cỏ
Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 tái sinh trên môi trường chọn lọc được chuyển ra trồng trên giá thể và sàng lọc bằng phết thuốc trừ cỏ (200 mg/l glufosinate) trên lá có ba lá chét. Sàng lọc bằng phết thuốc trừ cỏ trên lá được lặp lại 3 lần tại các vị trí khác nhau trên mỗi cây tái sinh.