Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra. Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi. Các dung môi thường dùng là n-hexan (C6H14), diclometan (CH2Cl2), etanol (C2H5OH).
2.4.3. Phương pháp ngấm kiệt
Chiết xuất ngấm kiệt được tiến hành bằng cách thường xuyên tác các chất chiết ra khỏi nguyên liệu. Phương pháp này thường xuyên dùng dung môi sạch nên có nhược điểm là mất nhiều thời gian.
2.4.4. Chiết siêu âm
Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng khả năng chiết xuất. Chiết siêu âm là phương pháp chiết sử dụng sóng với tần số 20000 Hz. Dùng siêu âm có thể rút ngắn thời gian chiết nhờ tác dụng của siêu âm, làm tăng diện tích giữa 2 pha bằng cách phân tán chúng ra thành những hạt nhỏ, phá vỡ các màng tế bào, tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp.
2.4.5. Chiết xuất ngược dòng
Nguyên tắc của chiết xuất ngược dòng là hướng di chuyển của dung môi ngược dòng với hướng di chuyển của nguyên liệu, bản chất là phương pháp chiết xuất nhiều lần được cải tiến để tận dụng khả năng hòa tan của dung môi. Nguyên liệu lần lượt được chiết bằng những dịch chiết có nồng độ hoạt chất giảm dần, nguyên liệu kiệt nhất sẽ được chiết xuất bằng dung môi mới và dùng làm dung môi chiết cho các bình tiếp theo.
2.4.6. Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn
Thay vì sử dụng các loại dung môi hữu cơ chúng ta có thể sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (31,10 C, 73 atm), nước ở trạng thái siêu tới hạn (3740 C, 218 atm) hay chất lỏng ở dạng ion tại nhiệt độ phòng, hệ 2 pha, hệ thống không có dung môi sử dụng bề mặt bên trong của đất sét, zeolit, silic oxit và nhôm. Sử
màu sắc, 9 hương vị hoàn toàn giống với tự nhiên, không bị biến đổi như trong các phương pháp chiết khác.
2.4.7. Tách chiết bằng dung môi
- Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng thích hợp ở nhiệt độ phòng. Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong dung môi với bên ngoài dung môi do chênh lệch nồng độ. Sau khi chiết phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu.
- Yêu cầu của dung môi chiết:
+ Có nhiệt độ sôi thấp, nhưng không quá thấp để hạn chế tổn thất dung môi và thuận lợi trong việc ngưng tụ hơi dung môi.
+ Không tương tác hóa học với tinh dầu. + Có khả năng thu hồi tái sử dụng.
+ Độ nhớt thấp để không làm giảm tốc độ khuếch tán
+ Có khả năng hòa tan tinh dầu lớn, nhưng hòa tan hợp chất không được hòa tan nước để tránh làm loãng dung môi và hạn chế khả năng hòa tan tinh dầu của dung môi.
+ Dung môi phải tinh khiết, không được ăn mòn thiết bị, không gây mùi lạ đối với tinh dầu và ít độc hại với con người.
+ Khi bay hơi dung môi không để lại cặn vì cặn còn lại từ dung môi có thể ảnh hưởng xấu hoặc phá hủy mùi thơm của tinh dầu.
+ Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm.
2.5. Một số phương pháp đánh giá tác động kháng khuẩn
2.5.1. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
- Nguyên lý: Dịch chiết được bơm vào các giếng thạch trong môi trường MHA đã được đục lỗ, bề mặt môi trường MHA có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm, mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết được biểu hiện bằng đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh các giếng thạch có chứa dịch chiết. Đối chứng dương là khoanh kháng sinh, đối chứng âm là nước cất.
2.5.2. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
- Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoang giấy khuếch tán vào thạch MHA có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với
kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính vòng kháng vô khuẩn xung quang giấy kháng sinh.
2.5.3. Phương pháp canh pha loãng Broth xác định giá trị MIC và MBC
Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration-MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration-MBC) là đại lượng định lượng tính nhạy cảm của một vi khuẩn phân lập đối với một kháng sinh nhất định. Như tên gọi đã thể hiện, MIC là nồng độ tối thiểu của một kháng sinh/mẫu vẫn có thể ngăn chặn sự phát triển của chủng vi khuẩn phân lập. Tương tự như vậy, MBC là nồng độ tối thiểu của một kháng sinh/mẫu dẫn tới giết chết vi khuẩn phân lập.
Phương pháp canh pha loãng Broth vận hành theo nguyên tắc tương tự, ngoại trừ kháng sinh được pha loãng tốt hơn trong các môi trường chất lỏng hơn trong môi trường thạch. Trong các thử nghiệm này, môi trường với độ pha loãng lớn nhất của một kháng sinh/mẫu mà vi khuẩn không phát triển thì đó chính là MIC. Hiện tại các phòng xét nghiệm vi sinh ở hầu hết các bệnh viện lớn đều sử dụng các máy dựa trên những nguyên tắc này để tự động kiểm tra hàng trăm chủng vi khuẩn phân lập.
Phần 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu
- Cây Mảnh cộng: Là các cá thể cây thu thập từ khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam (cây bản địa). Được lưu trữ tại vườn cây dược liệu của khoa CNSH – CNTP Đại học Nông Lâm Thái Nguyên với diện tích 100m2. Cây Mảnh cộng có tuổi
đời 01 năm, cây sinh trưởng tốt, chưa ra hoa, không có sâu bệnh và được trồng dưới tán vườn.
Hình 3.1 Cây Mảnh cộng 3.1.2. Chủng vi sinh vật thử nghiệm
Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc tại Khoa Vi Sinh – Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên
-Chủng Pseudomonas aeruginosa
- Chủng Escherichia coli
- Chủng Staphylococcus aureus
- Chủng Proteus
- Chủng Klebsiella pneumoniae
3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Thành phần môi trường MHA: - Dịch chiết thịt bò 2g
- Sản phẩm phân giải Casein 17,5g - Tinh bột 1,5g
- Agar 17g
Chuẩn bị môi trường MHA:
Cân chính xác 38g bột môi trường MHA, hòa tan với 1000ml nước cất và khuấy đều. Đem môi trường vừa pha đi chuẩn độ pH, sử dụng máy đo pH để kiểm tra độ pH của môi trường và điều chỉnh độ pH khoảng 7,2 – 7,4 (có thể dùng HCL 1% hoặc NaOH 1% để điều chỉnh pH). Mang đi hấp môi trường ở nhiệt độ 121 C trong 15 phút. Sau khi hấp xong, làm nguội môi trường đến nhiệt độ phòng, đổ môi trường vào 9 đĩa petri đã vô khuẩn với độ dày từ 3,5mm – 4,5mm. Các đĩa peptri phải đặt trên một mặt phẳng ngang và bằng để đảm bảo độ sâu của thạch ở mọi vị trí trong đĩa peptri bằng nhau.
3.1.4. Dụng cụ - thiết bị và hóa chấta. Thiết bị a. Thiết bị Bảng 3.1. Bảng danh sách thiết bị Thiết bị Tủ sấy Cân điện tử Máy lắc Máy đo pH Tủ cấy vô trùng
Máy cô quay chân không Nồi hấp tiệt trùng Tủ ấm b. Dụng cụ Bảng 3.2. Bảng danh sách dụng cụ Dụng cụ Cối Chày sứ Đĩa peptri
Que cấy vi sinh tiệt trùng (đầu tròn) Giấy lọc Micropipet Đèn cồn c. Hóa chất Các hóa chất được sử dụng: - Cồn 70% - HCl 1% hoặc NaOH 1%
- Khoanh giấy kháng sinh : FOX, CAZ, TZP, AK
Hình 3.2 Khoanh kháng sinh FOX Hình 3.3 Khoanh kháng sinh CAZ
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát khả năng kháng khuẩn từ dịch chiết cây
Clinacanthus nutans Burm.f Lindau.
Địa điểm: Khoa Vi Sinh - Bệnh viện Đa khoa TW Thái Nguyên. Thời gian: Từ 04/1/2021 đến 30/05/2021.
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 01: Nghiên cứu quy trình tách chiết dịch chiết từ cây Clinacanthus
nutans Burm.f Lindau.
- Nội dung 02: Đánh giá khả năng kháng một số vi khuẩn từ dịch chiết cây
Clinacanthus nutans Burm.f Lindau.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Xử lí nguyên liệu
Cây Mảnh cộng (01 năm tuổi) lấy toàn bộ lá tươi, non và không bị sâu bệnh, nấm mốc. Đem đi rửa sạch, sấy mẫu ở mức nhiệt độ là 50°C trong vòng 30 phút cho đến khi mẫu khô giòn, có khối lượng không đổi.
3.4.2. Phương pháp thu nhận dịch chiết
Phương pháp tách chiết tinh chất (crude extracts) từ mẫu thực vật được tiến hành như sau:
Nguyên liệu được thu hái, rửa sạch và sấy khô giòn, sau đó nghiền nhỏ thành bột rồi cân chính xác. Mẫu bột khô (g) và đong cồn 70% (ml) với tỉ lệ 1:20, được đựng vào bình tam giác 100ml. Lắc bằng máy lắc trong 14 tiếng ở nhiệt độ 30 C. Lọc 2
- 3 lần và thu lại dung dịch mẫu. Sau đó cô quay dung dịch mẫu và thu được cao chiết, đong 3 – 5 ml cồn 70% lắc đều bình chứa mẫu dung dịch để thu được cao chiết còn sót lại trong bình. Đem sấy hỗn hợp cao chiết ở nhiệt độ 50 C trong 24 tiếng để loại bỏ hoàn toàn cồn 70% còn lại trong hỗn hợp. Hòa tan cao chiết (g) thu
được (sau khi loại bỏ hoàn toàn cồn 70%) vào nước cất (ml) và đựng bằng ống Falcon để chuẩn bị cho thí nghiệm kháng khuẩn.
3.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn
a. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Tiến hành thí nghiệm:
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Ria cấy vi khuẩn mỗi loại trên mặt thạch MHA đã khô ổn định (nồng độ tế bào 106 vi khuẩn/ ml), sau đó làm khô trong tủ ấm khoảng 15 phút chờ khô bề mặt, đục lỗ giếng, nhỏ 200µl dung dịch dịch chiết vào giếng và đặt khoanh giấy kháng sinh đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch (để ở nhiệt độ phòng 30 phút). Chuyển các đĩa petri vào tủ ấm và đọc kết quả đường kính vòng vô khuẩn sau 16 - 18 giờ.
b. Nội dung phương pháp
Đem rửa sạch 9 đĩa petri và sau đó bọc giấy, đem sấy ở nhiệt độ 120 C trong 2 tiếng. Pha môi trường thạch MHA- nước cất theo tỷ lệ 38g - 1000ml. Đem môi trường vừa pha đi đo và điều chỉnh độ pH 7,2 -7,4 (có thể dùng HCl 1% hoặc NaOH 1% để điều chỉnh pH), sử dụng máy đo pH để kiểm tra độ pH của môi trường MHA. Mang đi hấp môi trường ở nhiệt độ 121 C trong 15 phút. Sau khi hấp xong, làm nguội môi trường đến nhiệt độ phòng, đổ môi trường vào 9 đĩa petri đã vô khuẩn với độ dày từ 3,5mm – 4,5mm và để trong tủ ấm.
Các thao tác ria cấy vi khuẩn được thực hiện trong tủ cấy vô trùng và trên ngọn lửa đèn cồn, sử dụng que cấy vi sinh tiệt trùng ria cấy vi khuẩn mỗi loại (lấy trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm đã có kết quả kháng sinh đồ) trên mặt thạch MHA đã khô ổn định (nồng độ tế bào 106 vi khuẩn/ml), mỗi loại chủng khuẩn với 03 lần lặp. Sau đó làm khô trong tủ ấm khoảng 15 phút chờ khô bề mặt, mỗi 1 đĩa petri đục 2 lỗ giếng, mỗi lỗ giếng có đường kính 8mm, chiều cao 4mm, sử dụng micropipet nhỏ 200µl dung dịch dịch chiết Mảnh cộng vào một giếng, giếng còn lại cũng sử dụng micropipet nhỏ 200µl nước cất, đặt khoanh giấy kháng sinh đè nhẹ để khoanh giấy cố định trên mặt thạch (để ở nhiệt độ phòng 30 phút). Sử dụng đối chứng âm là nước cất và đối chứng dương là khoanh giấy kháng sinh. Lật ngược đĩa, chuyển các đĩa petri vào tủ ấm và đọc kết quả đường kính vòng vô khuẩn sau 16 - 18 giờ.
Đường kính vòng vô khuẩn (D - d) được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn ngoài trừ đi đường kính giếng thạch dịch chiết.
D : Đường kính vòng kháng khuẩn Giếng nước cất d : Đường kính giếng thạch dịch chiết Khoanh giấy kháng sinh Đĩa petri có sẵn môi trường
và vi khuẩn
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nghiên cứu về quy trình thu nhận phù hợp để tách chiết dịch chiếttừ cây Clinacanthus nutans Burm.f Lindau từ cây Clinacanthus nutans Burm.f Lindau
- Quy trình thu nhận phù để tách chiết dịch chiết từ cây Clinacanthus nutans
Burm.f Lindau được áp dụng bằng phương pháp, quy trình tách chiết tinh chất (crude extracts) từ mẫu thực vật để phù hợp với trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất sẵn có tại khoa Vi sinh – Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên. Quy trình có thể tiết kiệm chi phí, tiết kiệm thời gian, đơn giản và phù hợp. Dịch chiết cây Clinacanthus
nutans Burm.f Lindau thu được đạt chất lượng tốt.
a. Quy trình chiết tách dịch chiết cây Clinacanthus nutans Burm.f Lindau. Nguyên liệu
Sấy khô, nghiền nhỏ
Bột khô được cho vào ethanol 70%
Lắc (trong 14 giờ) Lọc 2-3 lần Cô quay Ethanol 70% Hỗn hợp cao chiết Sấy Cao chiết
b. Thuyết minh quy trình
Bước 1: Lá cây Mảnh cộng (tươi, non) 01 năm tuổi đang trong độ tuổi phát
triển mạnh và chưa ra hoa, sau khi được thu hái loại bỏ những lá sâu, đem đi rửa sạch loại bỏ chất bẩn, rồi sấy trong vòng 30 phút ở nhiệt độ 50°C. Nghiền nhỏ thành bột rồi cân được 4 g (± 0,1 g).
Bước 2: 4g mẫu bột khô cây Mảnh cộng và đong 80ml cồn 70% với tỉ lệ 1:20
vào bình tam giác 100 ml.
Bước 3: Lắc bằng máy lắc trong 14 tiếng ở nhiệt độ 30°C.
Bước 4: Lọc 2 – 3 lần để loại bỏ bã và thu lại dung dịch mẫu.
Bước 5: Cô quay dung dịch mẫu và thu được cao chiết, đong 5 ml cồn 70% lắc
đều bình chứa mẫu dung dịch để thu hoàn toàn cao chiết còn sót lại trong bình.
Bước 6: Sấy hỗn hợp cao chiết ở nhiệt độ 50°C trong 24 tiếng để loại bỏ hoàn
toàn cồn 70%.
Bước 7: Thu được 510mg cao chiết. Hòa tan 510mg cao chiết vào 10 ml nước
cất để chuẩn bị cho thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus,
Klebsiella pneumoniae tại Khoa Vi sinh – Bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái
Nguyên.
c. Nội dung về quy trình thu nhận phù hợp để tách chiết dịch chiết từ cây
Clinacanthus nutans Burm.f Lindau.
Quá trình thu nhận tách chiết dịch chiết từ cây Clinacanthus nutans Burm.f Lindau được tiến hành qua 07 bước và có kết quả như sau:
Thí nghiệm được triển khai vào đầu tháng 4 năm 2021, thu hái lá cây Mảnh Cộng 01 năm tuổi (tươi, non) từ vườn cây dược liệu của khoa CNSH – CNTP Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đang trong độ tuổi phát triển mạnh và chưa ra hoa.
Hình 4.1 Cây Mảnh cộng
Sau khi được thu hái loại bỏ những lá sâu, đem đi rửa sạch loại bỏ chất bẩn, rồi sấy khô giòn bằng tủ sấy trong vòng 30 phút ở nhiệt độ 50°C. Nghiền nhỏ thành bột rồi cân được 4g bột khô Mảnh cộng (± 0,1 g).
Hình 4.2. Mẫu lá cây Mảnh cộng nghiền thành bột
4g mẫu bột khô cây Mảnh cộng và đong 80 ml cồn 70% với tỉ lệ 1:20 (đạt được nồng độ là 0,05g chất khô/ml dung môi) được đựng bằng bình tam giác 100ml, ngâm mẫu trong dung môi và đem đi lắc trong vòng 14 tiếng ở nhiệt độ 30°C.
Hình 4.3. Dung dịch mẫu Mảnh cộng
Lọc dung dịch mẫu Mảnh cộng 2 – 3 lần để loại bỏ bã và thu lại dung dịch mẫu.
Hình 4.5. Dung dịch Mảnh cộng sau khi lọc
Cô quay dung dịch mẫu và thu được cao chiết, đong 5 ml cồn 70% lắc đều bình chứa mẫu dung dịch để thu hoàn toàn cao chiết còn sót lại trong bình. Đem hỗn hợp cao chiết sấy ở nhiệt độ 50°C trong 24 tiếng để loại bỏ hoàn toàn cồn 70% và thu được 510mg cao chiết. Hòa tan 510mg cao chiết vào 10 ml nước cất để chuẩn bị cho thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Pseudomonas