Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Phân lập nấm men

Phân lập nấm men là quá trình tách nấm men từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết.

3.3.1.1. Quy trình phân lập nấm men

Giữ giống trong ống thạch nghiêng Chọn và rửa sạch dâu

Lên men (2 – 3 ngày)

Lắc tăng sinh trong 1 giờ (370C)

Pha loãng trong nước muối sinh lý

Phân lập

Hình 3.1 Quy trình phân lập nấm men từ trái dâu tằm 3.3.1.2. Thuyết minh quy trình

 Chọn và rửa sạch dâu: Chọn một vài quả dâu đã đạt đủ độ chín kỹ thuật, không bị dập nát, không có mùi lạ, đem rửa sạch vài lần với nước thường rồi ngâm với một ít nước muối để hạn chế sự phát triển của nấm mốc. Sau đó vớt ra để ráo nước.

 Lên men yếm khí: Dâu đã được rửa sạch cho vào một hũ nhựa nhỏ, bổ sung thêm đường rồi đậy kín. Cho lên men ở nhiệt độ thường trong 36-48 giờ.

 Lắc tăng sinh: Trước khi phân lập, mẫu nấm men phải được chuyển về dạng lỏng. Nhưng thay vì phải đồng nhất mẫu bằng cách nghiền nát, dịch lên men sẽ được chiết ra, lấy 1 ml pha loãng trong 99 ml môi trường peptone đệm (độ pha loãng 10-2), rồi tiến hành lắc tăng sinh ở 370C trong 1 giờ để nấm men thích ứng với môi trường mới.

 Pha loãng: Dịch tăng sinh được pha loãng dần vào các ống nghiệm chứa nước muối sinh lý để được các nồng độ pha loãng khác nhau.

Thao tác: Ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút, sau đó để nguội. Dùng pipetman hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào ống nghiệm thứ nhất để có độ pha loãng 10-3, trộn đều hỗn hợp trong ống nghiệm, sau đó tiếp tục hút 1 ml trong ống thứ nhất chuyển qua ống thứ hai để có được độ pha loãng 10-4, tiến hành tương tự với các độ pha loãng tiếp theo.

 Phân lập:

- Cấy trang: thực hiện cấy vào đĩa petri có chứa môi trường Hansen.

Cấy trang là thao tác đầu tiên trong quá trình phân lập, nhằm tạo ra khuẩn lạc đơn trên bề mặt thạch, các khuẩn lạc đơn này tiếp tục được làm thuần trong các bước tiếp theo của quá trình phân lập. Số lượng khuẩn lạc đơn sau khi cấy trang càng nhiều thì công đoạn làm thuần sẽ càng dễ thực hiện.

Thao tác: Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch pha loãng lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. Nhúng đầu que trang (que trải) thuỷ tinh vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa rồi để nguội trong khoảng không gian vô trùng của ngọn lửa. Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que trang lên bề mặt thạch, dùng đầu gạt xoay, trải dịch

giống lên bề mặt thạch. Sau khi trang đều, rút que trang ra khỏi đĩa, đậy đĩa và gói lại bằng giấy báo hoặc bao nilon. Ủ ở nhiệt độ 370C trong vòng 36 – 48 giờ.

 Làm thuần

- Cấy ria: cũng được thực hiện vào các đĩa petri có chứa môi trường Hansen. Cấy ria là bước tiếp theo sau cấy trang nhằm làm thuần khiết dần chủng nấm men cần phân lập.

Thao tác: 48 giờ sau khi cấy trang, quan sát khuẩn lạc trên bề mặt đĩa, chọn lọc khuẩn lạc đơn. Khuẩn lạc đơn của nấm men là những khuẩn lạc có dạng hình tròn, hơi lồi, màu trắng sữa. Sử dụng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống, chuyển qua một đĩa môi trường khác (chưa cấy), đặt nhẹ que cấy lên bề mặt thạch, ria các đường trên bề mặt thạch (ria chữ T, ria 4 góc). Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo. Cuối cùng, bao gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ thường hoặc 370C.

Cấy ria được tiến hành 3 – 4 lần để đảm bảo chủng nấm men thu được là thuần khiết. Quan sát khuẩn lạc trên bề mặt đĩa, nếu xuất hiện đa số khuẩn lạc đơn có hình dạng giống nhau, màu sắc đồng đều thì chứng tỏ chủng nấm men đã thuần khiết.

- Cấy chấm: Bước cuối cùng trước khi chuyển nấm men vào ống giữ giống. Cấy chấm nhằm mục đích tạo thành các khuẩn lạc đơn có số lượng lớn nấm men, thuận tiện cho việc quan sát, định danh và giữ giống.

Thao tác: Tăm tre bình thường được làm tù một đầu, đem hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Thao tác vô trùng thu giống bằng đầu được làm tù của que tăm, chuyển qua một đĩa môi trường khác, chấm nhẹ lên bề mặt thạch (chấm 3 chấm hoặc 9 chấm), gói đĩa petri rồi đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 36 – 48 giờ.

 Giữ giống: Có thể tiến hành giữ giống nấm men trong ống thạch nghiêng hoặc trong đĩa petri được dán kín bằng paraffin. Giữ giống giúp bảo quản chủng nấm men lâu dài, không bị nhiễm các chủng nấm men lạ, nấm mốc và các vi sinh vật khác. Tuy nhiên, sau một thời gian giữ giống, phải cấy chuyền để đảm bảo chủng nấm men không bị thoái hoá.

Thao tác: Đổ các ống thạch nghiêng chứa môi trường Hansen, sử dụng que cấy vòng thu giống trong đĩa petri, sau đó cấy ziczac lên môi trường bên trong ống

nghiệm, hơ đầu ống nghiệm, đậy nút bông, bọc kín đầu ống nghiệm bằng parafin. Giữ giống trong điều kiện lạnh 8-100C.

3.3.2. Nghiên cứu sản xuất nước lên men từ trái dâu tằm

3.3.2.1. Quy trình dự kiến sản xuất nước lên men từ trái dâu tằm

Dâu tằm (tươi, ít dập nát) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Rửa, phân loại

Ủ

Ép lấy dịch

Phối chế Nấm men

Thanh trùng (620C, 20 phút)

Lên men

Xử lý sau lên men (làm trong, điều vị)

Thanh trùng (60-630C, 20 phút) Chiết chai (thuỷ tinh 330 ml) Tăng sinh T0 = 40 – 420C T = 2 giờ Enzyme Pectinase Đường Na2CO3 Acid citric

Bảo quản trong tủ lạnh

Hình 3.2 Quy trình dự kiến sản xuất nước lên men từ trái dâu tằm

 Thuyết minh quy trình

Nguyên liệu là một trong các yếu tố quan trọng quyết định đến chất lượng sản phẩm vì vậy việc lựa chọn nguyên liệu để tiến hành lên men là một khâu hết sức quan trọng. Dâu tằm được mua tại Đà Lạt, Lâm Đồng, phải đảm bảo dâu mới được hái, chất lượng dâu tốt, ít quả dập nát, trong quá trình vận chuyển dâu được để trong các thùng xốp thoáng khí để hạn chế dập quả. Dâu sau khi vận chuyển phải được phân loại và rửa ngay, loại bỏ những quả dập nát và những quả chưa đủ độ chín kỹ thuật, rửa bằng nước 2 – 3 lần, có thể ngâm với một ít nước muối loãng để hạn chế nấm mốc, sau đó để ráo nước. Quá trình phân loại và rửa cần phải được tiến hành nhanh để tránh hiện tượng oxy hoá. Sau khi rửa dâu được mang đi bổ sung enzyme pectinase và ủ ngay trong khoảng thời gian 2 giờ ở 420C. Ủ với enzyme pectinase nhằm tăng hiệu suất ép dịch, làm giảm độ nhớt của dịch lên men, tăng chất lượng của dịch ép cả về mặt hoá lý lẫn cảm quan. Về hoá lý là hàm lượng đường nhiều hơn do quá trình thuỷ phân pectin tạo đường đơn. Về cảm quan là dịch trong, màu đẹp, tươi hơn so với dịch ban đầu.

Sau khi ủ, tiến hành ép để lấy dịch quả, dịch quả sau khi ép được lọc qua 3 – 4 lớp bông gòn và vải lọc xen kẽ để loại bỏ bớt cặn. Phối chế là công đoạn điều chỉnh nồng độ chất khô bằng cách bổ sung đường sacaroze, điều chỉnh pH bằng cách bổ sung Na2CO3 hoặc acid citric. Thanh trùng nhằm diệt một số vi sinh vật có hại cho nấm men, đặc biệt là nấm mốc. Tiến hành thanh trùng ở 620C trong 20 phút.

Để nguội dịch, sau đó tiến hành bổ sung nấm men để lên men ngay, tránh sự phát triển của các vi sinh vật gây hại, thao tác bổ sung nấm men phải được thực hiện bên ngọn lửa đèn cồn để hạn chế tạp nhiễm.

Tiến hành lên men 2 – 3 ngày, dịch dâu tằm sau khi lên men cần phải được làm trong và điều vị để có thể đảm bảo về mặt cảm quan. Làm trong bằng cách để lắng sau đó tiến hành lọc bằng vải lọc. Điều vị sản phẩm bằng syrup đường. Syrup đường được làm như sau: Nước và đường được phối trộn với tỉ lệ 1/7 sau đó đem đun sôi trong 10 phút.

Để nguội về 700C rồi tiếp tục bổ sung acid citric theo tỉ lệ nước/acid citric: 200/1 (g/g) nhằm để điều hoà vị. Tiếp tục đun sôi dịch tiếp trong vòng 10 phút nữa để hoà tan các thành phần vào dịch syrup. Làm nguội về 200C và đem đi sử dụng ngay, nếu chưa sử dụng thì tốt nhất nên bảo quản ở tủ lạnh.

Thanh trùng: Tiến hành thanh trùng ở 630C trong 20 phút để tiêu diệt toàn bộ nấm men, ổn định độ cồn của sản phẩm. Sau đó chiết chai thuỷ tinh 330 ml và bảo quản thành phẩm.

3.3.2.2. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng pectinase bổ sung đến lượng dịch ép thu được

Một hợp chất gluxit chiếm tỷ lệ khá lớn trong dâu tằm đó là pectin. Hợp chất này làm giảm chất lượng dịch ép dâu tằm. Do đó, để nâng cao chất lượng dịch ép thì phải tiến hành thuỷ phân gluxit này bằng enzyme pectinase.

Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ:

Hình 3.3 Quy trình xác định lượng enzyme bổ sung thích hợp khi ép dịch

Dâu tằm đã được phân loại và rửa sạch

Chọn ra 150 g mẫu

0 ml 0,02 ml 0,04 ml 0,06 ml 0,08 ml

Ủ ở 420C trong 2 giờ

Đánh giá chất lượng dịch ép

Enzyme pectinase

Hiệu suất thu dịch được tính theo công thức sau: Hiệu suất thu dịch (%) = LMDD( g)

(g) LDTD

x 100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

trong đó:

LDTD: khối lượng dịch thu được (g) LMDD: khối lượng mẫu đã dùng (g)

3.3.2.3. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men đến quá trình lên men nước dâu tằm

Tiến hành bố trí thí nghiệm theo hình:

Dâu tằm đã được phân loại và rửa sạch

Ủ với lượng enzyme pectinase thích hợp trong 2 giờ ở 420C

Điều chỉnh pH 3,5, nồng độ chất khô 240Bx

Bổ sung nấm men

3% V 5% V 7% V 9% V 11% V

Lên men ở 28 – 300C

Theo dõi các chỉ tiêu Brix, đường tổng, pH, acid tổng, cồn, số lượng nấm men

Hình 3.4 Quy trình xác định tỷ lệ giống bổ sung tối ưu

Lượng nấm men gieo cấy ban đầu liên quan mật thiết đến tiến trình lên men qua các chỉ số: - Thời gian để thiết lập được thế cân bằng động giữa quần thể nấm men với môi trường lên men: nếu mật độ gieo cấy càng nhiều thì thời gian càng ngắn và ngược lại.

- Lượng tế bào nảy chồi, liên quan đến lượng chất dinh dương bị tiêu phí cho việc các tế bào nấm men mới được sinh ra và phát triển

- Thời gian lên men: nếu lượng nấm men gieo cấy quá ít, khả năng nảy chồi của chúng không thể đạt mức tối đa cần thiết. Trong trường hợp như vậy, quá trình lên men bị “ì”, nghĩa là mức độ lên men thấp, thời gian lên men kéo dài.

- Hàm lượng các sản phẩm bậc hai tạo thành và tỷ số tương quan giữa chúng. Mật độ gieo cấy ban đầu càng lơn thì tỷ lệ số tế bào nảy chồi càng thấp, tốc độ sinh sản tương đối càng bé. Khi lượng tế bào nảy chồi ít thì cường độ trao đổi chất của tế bào non cũng thấp hơn và như vậy lượng sản phẩm bậc hai sẽ giảm đi tức là chất lượng nước lên men được nâng cao. Nhưng khi mật độ quá cao thì hiệu quả không cao, đôi khi phản tác dụng.

Chính vì vậy cần thiết phải thí nghiệm để xác định được tỉ lệ giống tối ưu cho quá trình lên men nước dâu tằm.

3.3.2.4. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khô đến quá trìnhlên men nước dâu tằm khi bổ sung nấm men lên men nước dâu tằm khi bổ sung nấm men

Trong nước ép dâu tằm nồng độ chất khô thường không đủ cho quá trình lên men, vì vậy cần phải bổ sung thêm đường saccaroza để điều chỉnh nồng độ chất khô. Hàm lượng bổ sung bao nhiêu còn tuỳ thuộc vào khả năng chịu đựng áp suất thẩm thấu của nấm men. Nếu nồng độ chất khô cao thì sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu trong môi trường, làm mất trạng thái cân bằng sinh lý của nấm men, nấm men chết do hiện tượng co nguyên sinh chất xảy ra trong nội bào. Nếu nồng độ chất khô thấp thì áp suất thẩm thấu của môi trường không đủ để ức chế các tạp khuẩn và nấm men hoang dại, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm nước lên men dâu tằm. Do đó chọn ra một nồng độ chất khô ban đầu thích hợp để vừa không gây chết nấm men, vừa hạn chế được tạp khuẩn, nâng cao hiệu suất lên men là một điều cần thiết.

Hình 3.5 Quy trình xác định lượng đường bổ sung tối ưu

3.3.2.5. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men nướcdâu tằm khi bổ sung nấm men dâu tằm khi bổ sung nấm men

Độ pH ảnh hưởng lớn tới hoạt động của nấm men, có khả năng làm thay đổi điện tích của chất keo của vỏ tế bào do tác động của nồng độ ion H+. Từ đó, chiều hướng của quá trình lên men có thể thay đổi, tuỳ thuộc vào sự tăng, giảm mức độ thẩm thấu chất dinh dương qua màng tế bào. Mỗi sinh vật chỉ hoạt động tốt ở trạng thái ion nhất định, trạng thái này lại phụ thuộc vào pH của môi trường. Vì vậy, việc xác định pH thích hợp

Ủ với lượng enzyme pectinase thích hợp trong 2 giờ ở 420C

Bổ sung đường

Điều chỉnh pH về 4,0, tỉ lệ giống tối ưu

220Bx 240Bx 260Bx

Lên men ở 18 – 200C

Theo dõi các chỉ tiêu Brix, đường tổng, pH, acid tổng, cồn, số lượng nấm men

Đường tối ưu

cho nấm men phát triển là điều rất cần thiết, giúp rút ngắn thời gian lên men, tăng hiệu suất lên men. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Tiến hành bố trí thí nghiệm theo Hình 3.6

Hình 3.6 Quy trình xác định lượng pH ban đầu tối ưu

3.3.2.6. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên mennước dâu tằm khi bổ sung nấm men nước dâu tằm khi bổ sung nấm men

Mỗi loài vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Xác định được khoảng nhiệt độ tối ưu cho nấm men phát triển sẽ giúp ích cho quá trình lên men, rút ngắn thời gian lên men, tăng chất lượng sản phẩm.

Ủ với lượng enzyme pectinase thích hợp trong 2 giờ ở 420C

Điều chỉnh pH

Đường bổ sung tối ưu, tỉ lệ giống tối ưu

3,0 4,0

Lên men ở 18 – 200C

Theo dõi các chỉ tiêu Brix, đường tổng, pH, acid tổng, cồn, số lượng nấm men

pH tối ưu

Dâu tằm đã phân loại, rửa sạch

Tiến hành bố trí thí nghiệm theo Hình 3.7

Hình 3.7 Quy trình xác định nhiệt độ tối ưu

3.3.3. Phương pháp đếm tổng số tê bào nấm men trong 1ml mẫu bằng buồng đếm hồng cầu

Vì kích thước tế bào khá lớn nên nấm men thường được đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. Đó là một phiến kính dày có 4 rãnh, chia thành 5 khoang ngang. Khoang giữa thấp hơn hai khoang hai bên 0,1 mm, được chia thành hai khoang nhỏ hơn nhờ một rãnh dọc. Trên mỗi khoang nhỏ này lại có kẻ một lưới đếm. Lưới đếm gồm nhiều ô vuông lớn có các ô vuông nhỏ bên trong, số lượng ô vuông tuỳ thuộc vào loại buồng đếm.

Ủ với lượng enzyme pectinase thích hợp trong 2 giờ ở 420C

Đường bổ sung tối ưu, tỉ lệ giống tối ưu, pH tối ưu

18 – 200C 28 – 300C Lên men

Theo dõi các chỉ tiêu Brix, đường tổng, pH, acid tổng, cồn, số lượng nấm men

Nhiệt độ tối ưu

Dâu tằm đã phân loại, rửa sạch

Điều chỉnh nhiệt độ

Kích thước các ô vuông nhỏ như sau: Cạnh : 1/20 mm. Diện tích bề mặt : 1/400 mm2 Chiều cao : 0,2 mm Thể tích : 1/4000 mm3

Cách tiến hành: Lấy 1 ml dịch lên men cho vào ống nghiệm đã có sẵn 9 ml nước

Vật liệu thí nghiệm