2.4.1. Chiết xuất các cặn chiết từ lá
Mẫu lá lồi Mỡ Phú Thọ (Magnolia chevalieri; 1.2 kg) được rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khơ, xay thành bột rồi ngâm chiết lần lượt với các dung mơi n-hexan, EtOAc và MeOH : H2O (9 :1). Sau khi cất loại dung mơi ở áp suất thấp thu được các cặn chiết tương ứng: n-hexane (MC1; 5.0g), EtOAc (MC2; 40.6g) và MeOH : H2O (MC3; 46.3g).
Sau khi tiến hành khảo sát sơ bộ bằng sắc ký bản mỏng các cặn chiết thu được, cặn chiết EtOAc (MC2) cĩ chứa nhiều chất cĩ khả năng dễ phân lập được lựa chọn để tiếp tục phân lập và tinh chế các hợp chất (Hình 2.5).
OD(chất thử) - OD(đối chứng) trắng)
OD(DMSO) - OD(đối chứng) trắng)
2.4.2. Phân lập các chất từ cặn chiết EtOAc của lá
Cặn chiết EtOAc (MC2; 40.6 gam) được đưa lên SKC silica gel bằng hệ dung mơi n-hexane : EtOAc với tỉ lệ lần lượt 98:2 → 95:5 → 90:10 → 87:13→ … → 50:50 thu được 25 phân đoạn (MC2.1 → MC2.25). Từ các phân đoạn này, tiếp tục phân lập, tinh chế các chất để xác định cấu trúc.
H: n-Hexan, C: CH2Cl2, E: EtOAc, M: MeOH
Hình 2.6 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn MC2.4 của cặn chiết EtOAc từ lá lồi Mỡ Phú Thọ
Phân đoạn MC2.4 (2.46 gam) được chạy SKC Silica gel với hệ dung mơi n- hexane 100% → n-hexane : EtOAc (99:1 → 97:3) thu được 5 phân đoạn (MC2.4.1 → MC2.4.5). Phân đoạn 2.4.2 (1.37 gam) được tiếp tục chạy SKC Silica gel với hệ dung mơi n-hexane 100% → n-hexane : CH2Cl2 (99:1 → 97:3 → 94:6) thu được 14 phân đoạn (MC2.4.2.1 → MC2.4.2.14). Phân đoạn MC2.4.2.10 (86.6 mg) được chạy SKC Silica gel với các hệ dung mơi n-hexane 100% → n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (99:1:0,1 → 98:2:0,1 → 95:5:0,1) thu được 4 phân đoạn (MC2.4.2.10.1 →
MC2.4.2.10.4). Phân đoạn MC2.4.3.10.3 (50.4 mg) được chạy SKC Sephadex LH- 20 với hệ dung mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (1:1:2) thu được 3 phân đoạn (MC2.4.2.10.3.1 → MC2.4.2.10.3.3). Trong đĩ, phân đoạn MC2.4.2.10.3.3 thu được chất sạch kí hiệu MPT9 (Chevalierinol B - chất mới, 5.4 mg). Phân đoạn 2.4.4 (719.2 mg) đưa lên cột Sephadex LH-20 với hệ dung mơi CH2Cl2 : n-hexane (8:2) thu được 6 phân đoạn (MC2.4.4.1 → MC2.4.4.6). Tiếp tục chạy SKC Sephadex LH-20 phân đoạn 2.4.4.4 với hệ dung mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (1:1:2) thu được 2 phân đoạn (MC2.4.4.4.1 → MC2.4.4.4.2). Phân đoạn MC2.4.4.4.2 thu được 15.2 mg hỗn hợp 2 chất MPT1 (Humulene oxide) và MPT2 (β-Caryophyllene oxide). Phân đoạn MC2.4.4.4.1 (91.0 mg) được chạy SKC Silica gel với hệ dung mơi n-hexane : CH2Cl2 (85:15) thu được chất sạch MPT8
(Chevalierinol A - chất mới, 10.8mg) (Hình 2.6).
H: n-Hexan, C: CH2Cl2, E: EtOAc, M: MeOH
Hình 2.7. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn MC2.8 và MC2.9 của cặn chiết EtOAc từ lá lồi Mỡ Phú Thọ
Phân đoạn MC2.8 (1.28 gam) được tiếp tục chạy SKC silica gel với hệ dung mơi n-hexane: CH2Cl2 (tỉ lệ 99:1 → 95:5 → 90:10 → 80:20) thu được 12 phân đoạn (MC2.8.1 → MC2.8.12). Phân đoạn MC2.8.5 (78.0 mg) được thực hiện chạy cột silica gel với hệ dung mơi n-hexane : EtOAc (tỉ lệ lần lượt 95:5 → 90:10 → 80:20 → 70:30) thu được 7 phân đoạn (MC2.8.5.1 → MC2.8.5.7). Phân đoạn MC2.8.5.6
cĩ chất kết tinh màu trắng, tiến hành rửa bằng MeOH lạnh (3 lần), sau đĩ với n-
hexane (3 lần) thu được chất sạch MPT6 (1-pentacosanol, 4.0 mg) (Hình 2.7). Phân đoạn MC2.9 (7.0 g) được chạy SKC silica gel với hệ dung mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (95:5:0,5) thu được 7 phân đoạn (MC2.9.1 → MC2.9.7). Phân đoạn MC2.9.5 (56.6 mg) được chạy SKC Silica gel với hệ dung mơi n-hexane 100% → n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (99:1:1 → 98:2:1 → 97:3:1 → 95:5:1) thu được 5 phân đoạn (MC2.9.5.1 → MC2.9.5.5). Trong đĩ, phân đoạn MC2.9.5.2 (2.9 mg) là một chất sạch kí hiệu MPT5 (Trans-2-phyten-1-ol, 2.9 mg). Phân đoạn MC2.9.6 (174.7 mg) được chạy SKC Sephadex LH-20 với hệ dung mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (1:1:2) thu được 2 phân đoạn (MC2.9.6.1 → MC2.9.6.2). Tiếp tục thực hiện SKC Silica gel phân đoạn MC2.9.6.2 (89.9 mg) với hệ dung mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (95:5:1) thu được chất sạch MPT4 (Caryophyllenol-II, 8.7 mg) (Hình 2.7).
H: n-Hexan, C: CH2Cl2, E: EtOAc, M: MeOH
Hình 2.8. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn MC2.12 và MC2.18 của cặn chiết EtOAc từ lá lồi Mỡ Phú Thọ
Phân đoạn MC2.12 (2.1 gam) được chạy SKC silica gel với hệ dung mơi n-
hexane : aceton (9:1) thu được 4 phân đoạn (MC2.12.1 → MC2.12.4). Phân đoạn MC2.12.3 (491.0 mg) được chạy SKC Rp với hệ dung mơi MeOH : H2O (3:1) thu được 9 phân đoạn (MC2.12.3.1 → MC2.12.3.9). Từ phân đoạn MC2.12.3.9 (61.0 mg) thu được chất sạch MPT7 (Obovatol, 61.0 mg) (Hình 2.8).
Phân đoạn MC2.18 (18.7 gam) được thực hiện chạy SKC silica gel với hệ dung mơi EtOAC : n-hexane (Tỉ lệ 1:1 → 6:4) thu được 12 phân đoạn (MC2.18.1 → MC2.18.12). Phân đoạn MC.2.18.5 (1.5 gam) được chạy SKC Rp với hệ dung mơi MeOH : H2O tỉ lệ 2:1 thu được 2 phân đoạn MC2.18.5.1 (81.0 mg) và
MC2.18.5.2 (191.0 mg). Phân đoạn MC2.18.5.1 (81.0 mg) thu được chất sạch
MPT3 (Caryolane-1,9-β-diol, 81.0 mg) (Hình 2.8).
Hỗn hợp chất MPT1 và MPT2 (Humulene oxide và β-Caryophyllene
oxide): Dạng dầu, khơng màu, C15H24O ; ESI-MS (m/z): 441 [2M+H]+ và 221 [M+H]+; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.1.
Chất MPT3 (Caryolane-1,9β-diol): Dạng dầu, màu vàng, C15H26O2 ; ESI-MS (m/z): 203 [M-2H2O+ H]+; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.2.
Chất MPT4 (Caryophyllenol-II): Dạng dầu, khơng màu, C15H24O; ESI-MS (m/z): 423 [2M-H2O+H]+, 405 [2M-2H2O+H]+, 203 [M-H2O+H]+; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.3.
Chất MPT5 (Trans-2-phyten-1-ol): Dạng bột, màu trắng, C20H40O; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz), δH (ppm), J (Hz): 5.41 (1H, t, J - 6.5, H-2), 4.15 (2H, d, J = 7.0, H-1), 3.64 (1H, t, J = 6.5, OH), 2.00 - 1.97 (2H, m, H-4), 1.67 (3H, s, H-20), 1.56 - 1.03 (19H, m, overlap, H-3 đến H-15), 0.89 - 0.83 (12H, d, J = 7.0, H-16, H-17, H-18, H-19); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz), δC (ppm): 140.33 (C-3), 123.10 (C-2), 59.44 (C-1), 39.87 (C-4), 39.38 (C-14), 37.44 (C-8), 37.37 (C-10), 37.30 (C-12), 36.67 (C-6), 32.80 (C-7), 32.70 (C-11), 27.98 (C-15), 25.15 (C-5), 24.79 (C-13), 24.47 (C-9), 22.71 (C-17), 22.62 (C-16), 19.75 (C-18), 19.72 (C-19), 16.17 (C-20).
Chất MPT6 (1-pentacosanol): Dạng bột, màu trắng, C25H52O; ESI-MS (m/z): 369 [M-H]-; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz), δH (ppm), J (Hz): 3,65 (2H, t, J = 6.5, H-1, CH2OH), 1.20 - 1.60 (47H, m, CH2), 0.88 (3H, t, J = 7.0, CH3); 13C NMR (CD3OD, 125 MHz), δC (ppm): 63.13 (C-1, CH2OH), 32.83, 31.94, 31.60, 29.71, 29.67, 29.63, 29.45, 29.37, 25.75, 25.29, 22.70, 22.26, 14.12 (CH3).
Chất MPT7 (Obovatol): Dạng dầu, khơng màu, C18H18O3 ; ESI-MS (m/z): 281 [M-H]-; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.4.
Chất MPT8 (Chevalierinol A): Dạng dầu, khơng màu; []24D - 20 (c = 0.2, MeOH); UV (MeOH) λmax nm (log ε): 235 (3.2), 213 (2.7); HR-ESI-MS m/z 521.2822 [M+Cl]- (tính tốn cho CTPT C33H42O3Cl, 521.2822); 485.3054 [M-H]- (tính tốn cho CTPT C33H41O3, 485.3056); Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.5.
Chất MPT9 (Chevalierinol B): Dạng dầu, khơng màu; 24
]
[ D -18 (c = 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax nm (log ε): 223.2 (2.5), 208.6 (2.1); HR-ESI-MS m/z 521.2830 [M+Cl]- (tính tốn cho CTPT: C33H42O3Cl, 521.2822); 485.3055 [M-H]- (tính tốn cho CTPT C33H41O3, 485.3056); Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.5.
2.5. Chiết xuất và phân lập các chất từ lồi Giởi đá 2.5.1. Chiết xuất các cặn chiết từ lá
Mẫu lá Magnolia insignis được sấy khơ (1.2kg), xay thành bột và được chiết siêu âm lần lượt với n-hexan, EtOAc và MeOH. Mỗi loại dung mơi được chiết lặp lại 3 lần. Sau khi cất loại dung mơi ở áp suất thấp thu được các cặn chiết tương ứng: AE1 (2.0 g, n-hexan), AE2 (6.0 g, ethylacetat), AE3 (70.0 g, MeOH).
2.5.2. Phân lập các chất từ cặn chiết MeOH của lá
Từ 70.0g cặn chiết MeOH (AE3 70.0 g) được tách bằng sắc ký cột với chất hấp phụ Diaion LH-20P, hệ dung mơi lần lượt là 100% H2O → MeOH : H2O (2:8 → 3:7 →5:5) →100% MeOH thu được 9 phân đoạn. Các phân đoạn được ký hiệu từ AE3.1 - AE3.9.
Phân đoạn AE3.5 (400.0 mg) được tách bằng sắc ký cột trên silica gel (đường kính cột d = 25 mm; chiều dài lớp silica gel l = 40 mm); với 50.0 gam chất hấp phụ silica gel rửa giải bằng hệ dung mơi CH2Cl2 : MeOH (9:1). Kiểm tra độ tinh khiết của các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung mơi là CH2Cl2 : MeOH ở các tỉ lệ khác nhau thu được 6 phân đoạn (AE3.5.1 → AE3.5.6). Phân đoạn AE3.5.3 (100.0 mg) được tách bằng sắc ký cột trên silica gel rửa giải bằng hệ dung mơi CH2Cl2 :MeOH (98:2) thu được chất sạch ký hiệu là GĐ3 ((+)- Afzelechin, 3.0 mg).
Phân đoạn AE3.8 (7.0 g) được tách bằng sắc ký cột trên silica gel (đường kính cột d = 40 mm; chiều dài lớp silica gel (l = 70 mm); với 300 gam chất hấp phụ silica gel rửa giải bằng hệ dung mơi CH2Cl2 : MeOH (98:2) tăng dần MeOH. Kiểm tra độ tinh khiết của các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), hệ dung mơi là
n-CH2Cl2: MeOH (98:2) ở các tỉ lệ khác nhau thu được 14 phân đoạn (AE3.8.1 → AE3.8.14). Phân đoạn AE3.8.5 (44.0 mg) được tách bằng sắc ký cột Sephadex LH- 20- LH-20 dung mơi rửa giải MeOH thu được chất sạch GĐ1 (Budlein B, 11.0 mg). Phân đoạn AE3.8.10 (36.0 mg) được tách bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 dung mơi rửa giải MeOH thu được chất chất sạch GĐ2 (Pinoresinol monomethyl ether-β- D-glucoside, 6.0 mg). Phân đoạn AE3.8.13 (44.0 mg) được tách bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 dung mơi rửa giải MeOH thu được 2 phân đoạn. Sắc ký cột điều chế chế phân đoạn AE3.8.13.2 với hệ dung mơi CH2Cl2 : MeOH (9:1), nhắc lại 3 lần thu được chất sạch GĐ5 (Kaempferol-3-O-β-D-xylopyranose, 6.0 mg) và GĐ6 (Astragalin, 10.0 mg). Phân đoạn AE3.8.14 (330.0 mg) được tách bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 dung mơi rửa giải MeOH thu được 5 phân đoạn. Phân đoạn AE3.8.14.5 (28.0 mg) được tách bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 dung mơi rửa giải MeOH thu được chất sạch GĐ4 (Nicotiflorin, 12.0 mg).
Hình 2.9. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết MeOH của lá lồi Giổi đá
Chất GĐ1 (Budlein B): Dạng dầu, khơng màu, C15H20O4; ESI-MS (m/z): 286.9 [M+Na]+; 1H và 13C NMR (CD3OD): xem bảng 3.6.
Chất GĐ2 (Pinoresinol monomethyl ether-β-D-glucoside): Dạng bột, màu
trắng, C27H34O11; ESI-MS (m/z): 518.9 [M-H]-, 543.0 [M+Na]+; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz), δH (ppm), J (Hz): 7.16 (1H, d, J = 8.5), 7.04 (1H, d, J = 2.0), 6.96 (1H, d, J = 2.0), 6.93 (1H, dd, J = 8.5, 2.0), 6.83 (1H, dd, J = 8.0, 1.5), 6.79 (1H, d, J = 8.0), 4.91 (1H, d, J = 7.0, H-1’’’-Glu), 4.78 (1H, d , J = 4.0), 4.72 (1H, d, J = 4.0), 4.28-4.23 (2H, m), 3.89, 3.88, 3.87 (9H, 3xs, 3xOCH3), 3.72-3.69 (1H, m), 3.55- 3.46 (2H, m), 3.41-3.41 (2H, m), 3.33.-3.32 (2H, m), 3.14-3.13 (2H, m). 13C NMR (CD3OD, 125 MHz): xem bảng 3.7.
Chất GĐ3 ((+)-Afzelechin): dạng bột, màu vàng, C15H14O5; ESI-MS (m/z): 274.8 [M+H]+, 272.8 [M-H]-; 1H và 13C NMR: xem bảng 3.8.
Chất GĐ4 (Nicotiflorin): Dạng bột, màu vàng, C27H30O15; ESI-MS (m/z): 617.1 [M+Na]+, 593.1 [M-H]-; 1H và 13C NMR: xem bảng 3.9.
Chất GĐ5 (Kaempferol-3-O-β-D-xylopyranose): Dạng bột, màu vàng, C20H18O10; ESI-MS (m/z): 416.8 [M-H]-, 418.7 [M+H]+;1H và 13C NMR: xem bảng 3.9.
Chất GĐ6 (Astragalin): Dạng bột, màu vàng, C21H20O11; (-)-ESI-MS (m/z): 448.0 [M]; 1H và 13C NMR: xem bảng 3.9.
2.6. Chiết xuất và phân lập các chất từ lồi Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba) 2.6.1. Chiết xuất các cặn chiết từ vỏ thân và rễ 2.6.1. Chiết xuất các cặn chiết từ vỏ thân và rễ
Mẫu vỏ thân và rễ lồi Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba; 5.0 kg) thu hái tại Xuân Mai, Hà Nội được cắt nhỏ, sấy khơ, xay bột, chiết với EtOH : H2O (9:1, 8 lít x 24 giờ 3 lần) ở nhiệt độ phịng. Cao tổng sau khi cơ đuổi dung mơi được chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, EtOAc và BuOH. Mỗi loại dung mơi được chiết lặp lại 3 lần. Sau khi cơ đuổi dung mơi ở áp suất thấp thu được các cặn chiết tương ứng: NLTH (18.6 g, n-hexan), NLTE (94.0 g, EtOAc, NLTB (70.0 g, BuOH).
2.6.2. Phân lập các chất từ cặn chiết n-hexan của vỏ thân và rễ
Cặn chiết n-hexane (NLTH; 18.6 gam) được đưa lên SKC silica gel bằng hệ dung mơi n-hexane : EtOAc với tỉ lệ lần lượt 98:2 → 95:5 → 90:10 → 87:13→ … → 50:50 thu được 17 phân đoạn (NLTH1 → NLTH17). Phân đoạn NLTH7 xuất hiện kết tinh, rửa và kết tinh lại thu được NLT2.1 (426.4 mg), đưa lên cột silica gel với hệ dung mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (9:1:0.1) thu được 3 phân đoạn (NLT2.1.1 → NLT2.1.3). Phân đoạn NLT2.1.1 được chạy sắc ký điều chế với hệ dung mơi n-hexane : EtOAc (95:5) thu được chất sạch NLT1 (Costunolide, 6.5 mg). Phân đoạn NLTH4 (397.1 m) thực hiện chạy SKC silica gel với hệ dung mơi n-
hexane: CH2Cl2 : MeOH (5:5:0.1 → 1:9:0.1) thu được 9 phân đoạn (NLTH4.1 → NLTH4.9). Phân đoạn NLTH4.6 (50.0 mg) tiếp tục được chạy SKC với hệ dung mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (5:5:0.1 → 1:9:0.1) thu được 4 phân đoạn (NTLH4.6.1 → NLTH4.6.4). Phân đoạn NLTH4.6.3 (25.0 mg) được chạy SKC sephadex LH-20 với hệ dung mơi mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH ( 1:1:2) thu được 3 phân đoạn (NLTH4.6.3.1 → NLTH4.6.3.3). Phân đoạn NLTH4.6.3.2 (25.0 mg) tiếp tục được chạy SKC điều chế với hệ dung mội CH2Cl2 : EtOAc (100:0.1) thu được chất sạch NLT2 (α-cadinol, 12.0 mg). Phân đoạn NLTH5 (374.2 mg) cĩ kết tinh hình kim, rửa kết tinh và kết tinh lại nhiều lần bằng dung mơi n-hexan thu được chất sạch NLT3 (Dihydro-β-cyclocostunolide, 5.6 mg). Phân đoạn NLTH13 (2.66 g) được chạy SKC silica gel với hệ dung mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (5:5:0.1 → 1:9:0.1) thu được 5 phân đoạn (NLTH13.1 → NLTH 13.5). Phân đoạn
NLTH13.2 xuất hiện kết tinh hình kim, rửa kết tinh và kết tinh lại nhiều lần bằng dung mơi n-hexan thu được chất sạch NLT4 (Dihydroparthenolide, 6.0 mg).
Hình 2.10. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết n-hexane của vỏ thân và rễ lồi Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba)
Chất NLT1 (Costunolide): Kết tinh hình kim, khơng màu, C15H20O2; ESI- MS (m/z): 232.9 [M+H]+, 214.9 [M-H2O+H]+ ; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.10.
Chất NLT2 (α-cadinol): Kết tinh hình kim, khơng màu, C15H26O; ESI-MS (m/z):222.5[M+H]+, 246 [M+Na+H]+; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.11
Chất NLT3 (11α,13-Dihydro-β-cyclocostunolide): Kết tinh hình kim,
khơng màu, C15H22O2;ESI-MS (m/z): 234.9 [M+H]+, 216.8 [M+H-H2O]+ ; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.12.
Chất NLT4 (11α,13-Dihydroparthenolide): Kết tinh hình kim, khơng màu,
C15H22O3; ESI-MS (m/z): 248.8 [M-H]-, 232.8 [M+H-H2O]+ ; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.15.
Phần cặn chiết EtOAc cịn lại (94.0 gam) được đưa lên cột sắc ký diaion với hệ dung mơi MeOH : H2O (8 :2) → MeOH (100%) thu được 25 phân đoạn (NLTE1 → NLTE25). Phân đoạn NLTE4 (1.0 gam) tiếp tục được chạy sắc ký cột với hệ dung mơi n-hexane - EtOAc (8 :2) thu được 15 phân đoạn (NLTE4.1 → NLTE4.15). Phân đoạn NLTE4.1 (8.0 mg) xuất hiện kết tinh, rửa sạch thu được chất NLT5 (Parthenolide, 5.5 mg). Phân đoạn NLTE4.10 (77.0 mg) được chạy SKC sephadex LH-20 với hệ dung mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (1:1:2) thu được 3 phân đoạn (NLTE4.10.1 → NLTE4.10.3). Phân đoạn NLT4.10.2 (65 mg) được đưa lên cột sắc ký rửa giải với hệ dung mơi mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH (1:9:0.1) thu được chất sạch NLT7 (9β-hydroxy-dihydroparthenolide, 6.7 mg). Phân đoạn NLTE4.13 (380.0 mg) được đưa lên cột chạy SKC silica gel với hệ dung mơi n- hexane : CH2Cl2 (97:3) thu được 4 phân đoạn (NLTE4.13.1 → NLTE4.13.4). Phân đoạn NLTE4.13.3 (11.0 mg) được chạy sắc ký điều chế với hệ dung mơi n-hexane : EtOAc : MeOH (2:8:0.1) thu được chất sạch NLT8 (Magnograndiolide, 8.0 mg). Phân đoạn NLTE6 (1.1 gam) tiếp tục được chạy SKC silica gel với hệ dung mơi n-
hexane : EtOAc : NH3 (7:3:0.1) thu được 22 phân đoạn (NLTE6.1 → NLTE6.22). Phân đoạn NLTE6.10 (96 mg) tiếp tục được chạy sephadex LH-20 rửa giải bằng MeOH (100%) thu được 3 phân đoạn (NLTE6.10.1 → NLTE6.10.3). Phân đoạn NLTE6.10.2 (42 mg) được chạy SKC RP với hệ dung mơi acetone : H2O (7:3) thu được 3 phân đoạn (NLTE6.10.2.1 → NLTE6.10.2.3). Phân đoạn NLTE6.10.2.3 (12 mg) xuất hiện kết tinh, chạy SKC điều chế với hệ dung mơi n-hexane : acetone (6:4) thu được chất sạch, ký hiệu NLT6 ((-)-bisparthenolidine, 8.0 mg). Phân đoạn NLTE10 (2.0 gam) đưa lên cột sắc ký silica gel với dung mơi CH2Cl2 (100%) thu được 7 phân đoạn (NLTE10.1 → NLTE10.7). Phân đoạn NLTE10.2 (11.0 mg) tiếp tục được chạy sắc ký điều chế với hệ dung mơi n-hexane : acetone : MeOH (9:1:0.1) thu được chất sạch NLT1 (Costunolide). Phân đoạn NLTE10.5 (280.0 mg) được chạy SKC silica gel với hệ dung mơi mơi n-hexane : CH2Cl2 : MeOH : NH3 (1.5:8.5:0.1:0.1) thu được chất sạch NLT9 (Liriodenine, 5.5 mg).
Chất NLT5 (Parthenolide): Tinh thể rắn, khơng màu, C15H20O3; ESI-MS (m/z): 20.8 [M+Na]+; 519.0 [2M+Na]+. Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.13.
Chất NLT6 ((-)-bisparthenolidine): Tinh thể rắn, C30H43NO6; ESI-MS (m/z): 514.0 [M+H] +, 278 [M-235]; HR-ESIMS (m/z) : 514.3163 (Tính tốn cho CTPT C30H44NO6]; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.14.
Chất NLT7 (9β-hydroxy-dihydroparthenolide): Tinh thể rắn, khơng màu,
C15H22O4; ESI-MS (m/z): 266.9 [M+H]+, 248.8 [M+H-H2O]+ ; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.15.
Chất NLT8 (Magnograndiolide): Dạng bột, C15H22O4; ESI-MS (m/z): 254.5 [2M+Na] +; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.16.
Chất NLT9 (Liriodenine): Kết tinh hình kim, màu vàng, C17H9NO3; ESI- MS (m/z): 275 [M]+ ; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.17.
Hình 2.11. Sơ đồ phân lập các chất sạch từ cặn chiết EtOAc của vỏ thân và rễ lồi Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba)
2.6.4. Phân lập các chất từ cặn chiết BuOH của vỏ thân và rễ
Cặn chiết n-BuOH (NLTB; 20.0 gam) được chạy SK silica gel với hệ dung mơi CH2Cl2 : MeOH (95:5) → MeOH (100%) thu được 6 phân đoạn (NLTB1 → NLTB6). Phân đoạn NLTB2 được chạy SKC với dung mơi CH2Cl2 (100%) →
CH2Cl2 MeOH (1 :1) thu được chất NLT9 (Liriodenine). Phân đoạn NLTB6 được
chạy SKC silica gel với hệ dung mơi CH2Cl2 : MeOH : H2O (6:1:0.1) thu được 5 phân đoạn (NLTB6.1 → NLTB6.5). Phân đoạn NLTB6.2 tiếp tục được chạy SKC silica gel rửa giải bằng CH2Cl2 : MeOH : H2O (6:1:0.2) thu được 10 phân đoạn (NLTB6.2.1 → NLTB6.2.10). Phân đoạn NLTB6.2.2 được chạy sắc ký điều chế với hệ dung mơi CH2Cl2 : MeOH : H2O (4:0.5:0.2) thu được chất NLT10 (albaside - Chất mới, 6.0 mg). Phân đoạn NLTB6.3 được chạy SKC với hệ dung mơi CH2Cl2 : MeOH : H2O (6:0.5:0.1) thu được 7 phân đoạn (NLTB6.3.1 → NLTB6.3.7). Phân đoạn NLTB6.3.3 xuất hiện kết tinh, lọc và rửa với MeOH thu được chất NLT11
(lawsoniaside B, 10.0 mg).
Hình 2.12. Sơ đồ phân lập các chất sạch từ cặn chiết BuOH của vỏ thân và rễ lồi Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba)
Chất NLT10 (albaside): tinh thể, màu trắng, C21H32O9; HR-ESI-MS m/z 463.1734 [M+Cl]- (tính tốn cho CTPT C21H32O9Cl, 463.1740); Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.18.
Chất NLT11 (lawsoniaside B): dạng bột, màu vàng, C17H24O9 ; ESI-MS (m/z): 395 [M+Na]+; Dữ liệu phổ 1H và 13C NMR: xem bảng 3.19.
2.6.5. Chiết xuất tinh dầu của lá và cành loài Ngọc lan hoa trắng
Mẫu lá và cành lồi Ngọc lan hoa trắng (Michelia alba) thu hái tại thành phố Đồng Hới, tỉnh Quảng Bình được xử lý sơ bộ nhằm loại bỏ các tạp chất cơ học, rửa sạch, để ráo nước. Mẫu sau đĩ được cắt nhỏ từ 2 - 3 cm và cho vào nồi áp suất. Thêm nước cất vào nồi đến thể tích khoảng 2/3 nồi và lắp kín hệ thống. Mỗi nồi chưng cất chứa 1000 gam nguyên liệu tươi đối với mẫu lá và 2500g đối với mẫu cành. Đun hỗn hợp ở nhiệt độ khoảng từ 60 - 800C trong khoảng 3 giờ đồng hồ. Sau khi chưng cất, tinh dầu lá và cành lồi Ngọc lan hoa trắng được loại bỏ nước và chiết lại bằng dung mơi n-hexane.
Tinh dầu lá lồi Michelia alba thu được là chất lỏng dạng dầu, khơng màu, nhẹ hơn nước, khơng tan trong nước, cĩ mùi thơm đặc trưng với hàm lượng 0.12% so với khối lượng nguyên liệu tươi.
Tinh dầu cành lồi Michelia alba thu được là chất lỏng dạng dầu, màu vàng, nhẹ hơn nước, khơng tan trong nước, cĩ mùi thơi đặc trưng với hàm lượng 0.048% so với khối lượng nguyên liệu tươi.
2.6.6. Xác định thành phần hĩa học tinh dầu lá và cành
Mẫu tinh dầu được phân tích thành phần hĩa học trên máy sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS) của hãng Agilent Technologies HP7890A, cột HP5-MS(dài 60 m; đường kính 0.25 mm; phim dày 0.25 m) liên hợp với máy khối phổ Agilent 5975C, khí mang Heli (0,1 mL/phút). Chương trình nhiệt độ: 60oC - 240oC, tăng 4oC/phút. Nhiệt độ inlet: 250oC, nhiệt độ MSD: 270oC. Thư viện phổ HPCH1607,