- Thu mẫu: Mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây
2.2.3.1. Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa
Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn đối kháng theo phương pháp của (W. Shun et al , 2001). Gồm các phản ứng: Gram, hiếu khí, kỵ khí, phát triển trên môi trường YDC, phát quang trên môi trường KB, khuyếch tán trên môi trường KB, phân giải Ure, Oxidase, phát triển trên môi trường thạch D1M...
- Phản ứng Gram: Lấy một đầu que cấy chủng vi khuẩn cần xác định cho vào 2 giọt KOH 3 % và trộn đều. Nếu thấy hỗn hợp này nhớt tức là phản ứng Gram âm, nếu không nhớt là phản ứng Gram dương.
- Khả năng phát quang trên môi trường KB: Cấy vi khuẩn cần xác định thành các vệt trên môi trường KB và nuôi ở 250
C. Sau 48 h quan sát khả năng phát quang dưới đèn tử ngoại với bước sóng 366 nm.
- Phát triển hiếu khí và kỵ khí:
Môi trường Basal: Pepton 2,0 g; NaCl 5,0 g; KH2PO4 0,3 g; thạch 3 g; bromothymol blue (1% dung dịch nước) 3ml; nước cất 1000ml; pH 7,0.
Lấy 5 ml môi trường Basal cho vào các ống tuýp dài 13 cm và khử trùng ở 1210 C trong 20 phút, sau đó bổ sung vào mỗi ống tuýp đó 0,5 ml dung dịch glucoza 10% đã khử trùng. Cấy các chủng cần xác định vào các ống tuýp đó, mỗi chủng cấy hai ống, một ống để bình thường (xác định hiếu khí), ống còn lại phủ lên trên bề mặt một lớp parafin dầy khoảng 5 mm (xác định kỵ khí), nuôi ở 300 C và quan sát sự biến đổi màu. Các chủng có khả năng phát triển là các chủng làm biến đổi màu của môi trường từ màu xanh sang màu vàng.
- Phát triển trên môi trường YDC:
Môi trường YDC: Cao nấm men 10,0 g; glucoza 20,0 g; CaCO3 20,0 g thạch 15,0 g; nước cất 1000ml; pH 7,0.
Cấy các chủng cần xác định trên môi trường YDC, nuôi ở nhiệt độ 300C và quan sát sự phát triển.
- Phát triển trên môi trường D1M:
Môi trường D1M: Cellobioza 5,0 g; NH4Cl 1,0 g; NaH2PO4 1,0 g; K2HPO4
1,0 g; MgSO4.7H2O 3,0 g; Malachine green 10,0 mg; thạch 15,0 g; nước cất 1000 ml; pH: 7,0.
- Sắc tố không phát quang trên môi trường KB: Cấy vi khuẩn cần xác định thành các vệt trên môi trường KB và nuôi ở 250
C. Sau 48 h quan sát khả năng không phát quang dưới đèn tử ngoại với bước sóng 366 nm.
- Thử Urease: chuẩn bị môi trường.
Môi trường YS cải tiến (800 ml): Cao nấm men 1,0 g; NH4H2PO4 0,5 g; K2HPO4 0,5 g; MgSO4.7H2O 0,2 g; NaCl 5,0 g; đỏ cresol 16 mg. Sau khi khử trùng bổ sung dung dịch Urea (20 g trong 180 ml nước cất, lọc vô trùng bằng phễu lọc có kích thước lỗ 0,02 µm).
Phương pháp tiến hành: Nuôi lắc vi khuẩn nghiên cứu trong ống nghiệm (5 ml) có chứa môi trường YS có urea, ống đối chứng (-) chỉ có môi trường YS có urea không cấy vi khuẩn, ống đối chứng (--) cấy vi khuẩn trong môi trường YS không có ure, Đối chứng (+) môi trường YS có urea và cấy vi khuẩn Ralstionia solanacearum.
Phản ứng dương tính (sinh urease) khi mầu vàng của môi trường có bổ sung urea có màu đỏ đậm, ống đối chứng (-), đối chứng (--) vẫn giữ được màu vàng, ống đối chứng (+) có màu đỏ đậm.
- Thử Oxidaza: Dùng que tăm khử trùng lấy sinh khối vi khuẩn nuôi cấy 24h trên môi trường KB chà sát lên miếng giấy thấm đã tẩm dung dịch 1% tetramethyl – p - phenylenediamine dihydrochloride. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hồng trong vòng 10 giây và phản ứng âm tính nếu không biến đổi màu sau 60 giây.
- Hình thành bào tử (nhuộm bào tử): Tiến hành làm hai cách song song.
Cách 1: Dịch hóa sinh khối vi khuẩn nghiên cứu trong ống eppendorf chứa nước cất khử trùng, Nhỏ 1 giọt dịch huyền phù vi khuẩn lên trên lam kính và để khô trong không khí, nhuộm mẫu bằng dung dịch lục malachite 5% trong vòng 10 phút, rửa nhẹ nhàng mẫu dưới vòi nước chảy trong 2 phút sau đó để khô trong không khí (30 phút), nhuộm tiếp lần 2 bằng dung dịch safranin trong vòng 15 giây, rửa lại mẫu dưới vòi nước chảy, sau dó thấm khô mẫu, đem quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40. Tế bào sinh dưỡng có mầu đỏ, bào tử có màu xanh.
Cách 2: Chia dịch huyền phù vi khuẩn thành 2 phần. Phần thứ nhất được xử lý nhiệt ở 90 - 950 C trong vòng 5 phút, sau đó tran dịch huyền phù đã xử lý nhiệt và không xử lý nhiệt trên môi trường dinh dưỡng (Thạch thịt – Pepton hoặc King B) nuôi cấy ở nhiệt độ 30 0
C trong vòng 24 h – 48 h. Quan sát sự hình thành khuẩn lạc.
Nếu như vi khuẩn nghiên cứu vừa có tế bào màu xanh (như cách 1) và dung dịch xử lý nhiệt vẫn có khuẩn lạc phát triển thì vi khuẩn đó có khả năng sinh bào tử (dương tính) còn lại là âm tính (không sinh nội bào tử).