Phần 3 Vật liệu, phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.3. Phương pháp kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật trong nước sử dụng cho
cho các điểm giết mổ lợn.
3.3.3.1. Chuẩn bị và lấy mẫu
Tiến hành lấy mẫu theo “Thường quy kỹ thuật y học lao động và vệ sinh môi trường” của Viện y học lao động và vệ sinh môi trường, Hà Nội 1993.
- Mẫu nước được lấy trong các bể chứa tại các điểm giết mổ hoặc hứng trực tiếp từ vòi. Dụng cụ lấy là chai thủy tinh nút mài đã được tiệt trùng. Trước khi lấy mẫu cần ghi rõ nhãn mác, địa điểm và thời gian lấy mẫu. Mẫu sẽ không được phân tích nếu không rõ nguồn gốc.
- Mẫu được bảo quản trong phích đá, hộp lạnh nếu không thể vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm trong vòng 2 giờ.
3.3.3.2. Phương pháp kiểm tra một số vi sinh vật chỉ điểm trong nước sử dụng cho giết mổ
a) Phương pháp xác định TSVKHK trong 1 ml nước
+ Lấy mẫu: Lấy mẫu nước máy tại vòi nước: trước khi lấy mẫu cần mở vòi cho nước chảy hết cỡ trong vòng 2 - 3 phút. Sau đó đóng vòi lại và khử khuẩn kỹ vòi nước ở nhiệt độ cao bằng bông cồn. Mở lại vòi cho nước chảy mạnh 1 - 2 phút rồi điều chỉnh cho chảy vừa đủ để lấy mẫu vào chai nút mài 500 ml đó được hấp, sấy tiệt trùng. Thao tác lấy mẫu cần phải vô trùng, mẫu đó lấy phải bảo quản lạnh sau đó chuyển về phòng thí nghiệm trong ngày.
Lấy mẫu tại bể chứa nước: khử trùng giá cây inox bằng cồn 70 độ, đặt chai nút mài 500 ml (đã được hấp, sấy tiệt trùng) có buộc dây ở nắp vào giá cây treo. Thả chai lấy mẫu xuống độ sâu 0,3 - 0,5 m, giật dây nút mài để nước chảy vào đầy chai thì kéo lên, nghiêng cây giá đổ bớt phần nước trong chai mẫu, đậy
nút mài và ghi nhãn, bao gói, bảo quản lạnh và đưa mẫu về phòng thí nghiệm. + Sử dụng phương pháp xét nghiệm vi khuẩn nguồn nước theo quy trình của Viện Y Học Lao Động và Vệ Sinh Môi Trường TCVN 4833-2:2002 và TCVN 2680-78 quy định về nước sử dụng cho cơ sở giết mổ.
+ Pha loãng mẫu: Pha loãng mẫu theo bậc thập phân, chuẩn bị một dãy ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước sinh lý vô trùng, đánh số thứ tự 1, 2, 3... Hút 1 ml nước mẫu cho vào ống nghiệm thứ nhất, trộn đều, ta được độ pha loãng 10-1. Dùng pipet vô trùng hút 1ml ở ống nghiệm 1 đưa sang ống 2, trộn đều được dung dịch 2 pha loãng 10-2... Tiến hành tương tự ta được các dung dịch với đậm độ 10-3, 10-4... (chú ý mỗi đậm độ pha loãng dùng một đầu pipet tiệt trùng riêng).
+ Cấy mẫu: sử dụng phương pháp cấy láng. Với mỗi mẫu nước kiểm nghiệm cần nuôi cấy trên 3 đậm độ liên tiếp, mỗi đậm độ trên 2 đĩa thạch.
Dùng micro pipet hút 0,1 ml huyễn dịch ở các đậm độ khác nhau cấy vào đĩa petri có chứa thạch PCA. Xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ và ngược lại, dùng que cấy láng dàn đều huyễn dịch nuôi cấy trên mặt thạch. Đánh dấu số mẫu, độ pha loãng, bao gói và cho vào tủ ấm đã điều chỉnh nhiệt độ 370C, sau 24h đem ra đọc kết quả.
+ Đọc kết quả: Chọn tất cả các đĩa thạch có từ 15 - 300 khuẩn lạc để tính kết quả. Sự phân bố khuẩn lạc trên đĩa thạch nuôi cấy ở các đậm độ khác nhau phải hợp lý. Kết quả được tính toán theo công thức (Takeshi et al., 2009).
(Takeshi)
Trong đó:
+ ∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp nhau.
+ V: Thể tích mẫu (ml) cấy vào môi trường.
+ n1, n2: số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn. + d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất. + C.F.U (Colonies Forming Units): số đơn vị khuẩn lạc.
b) Phương pháp xác định Coliforms và E.coli
Nguyên tắc: Mẫu được pha loãng theo hệ số thập phân, ủ trong ống chứa
môi trường thích hợp có ống Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ trong 3 ống môi trường. Xác định ống dương tính thông qua theo dõi sự sinh hơi và đổi màu của từng ống. Ghi nhận các ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng, tra bảng MPN để tính số lượng vi sinh vật có trong 1 g hay 1 ml mẫu ban đầu.
● Xác định Coliforms
Từ mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10 ml môi trường LTS (Lactose TriptoneSulphat lauryl Broth), mỗi mẫu ít nhất phải nuôi cấy ít nhất trên 3 nồng độ pha loãng, ở đây chúng tôi cấy 3 nồng độ 10-2, 10-
3, 10-4, cấy 1 ml vào mỗi ống. Để vào tủ ấm 37oC, sau 48 giờ đọc kết quả.
● Xác định E.coli
Cấy và ủ trong môi trường canh thang Brilliant Green: Sử dụng phương pháp 9 ống, mỗi ống có 10 ml môi trường và 1 ống Durham. Chọn 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng cấy 1 ml vào 3 ống môi trường. Lắc nhẹ ống môi trường để ống Durham chìm xuống, không có bọt khí trong ống Durham.
Ống dương tính là những ống có sinh hơi, ống Durham nổi lên, môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng nhạt.
+ Cấy chuyển và ủ vào môi trường chọn lọc canh thang EC: Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống BGBL (+) sang các ống canh EC ủ ở 44,50C. Đếm các ống cho kết quả (+). Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường thạch đĩa EMB. Ủ các đĩa này ở 370C/24h để tìm các khuẩn lạc tròn, dẹt, có ánh kim tím.
+ Tiến hành thử nghiệm khẳng định E.coli
Để khẳng định chính xác E.coli, ta tiến hành các thao tác sau: Cấy chuyển lên môi trường T.S.I, thử phản ứng sinh hóa trên dãy phản ứng IMViC.
Kết quả xác định là E.coli nếu:
+ Môi trường T.S.I chuyển sang màu vàng cả phần mặt đáy và mặt nghiêng, vi khuẩn có sinh hơi, không sinh H2S.
+ Dãy phản ứng IMViC cho kết quả (+ + - -).
+ Ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và IMViC như trên là
ống E.coli (+). Thực hiện tương tự cho tất cả các ống nghiệm cho kết quả (+) trong
môi trường EC và tạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.
Đọc kết quả:
Ở tất cả các trường hợp trên, từ số lượng các ống nghiệm E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu dùng bảng MPN thích hợp (bảng 4x3 tức 9 ống nghiệm) để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.
Xác định số ống dương tính ở mỗi độ pha loãng, từ đó tra bảng MPN thích hợp, tính kết quả theo công thức sau:
MPN/g hay MPN/ml = (MPN/g hay ml trong bảng : 100)x số lần pha loãng mẫu của nồng độ ở giữa.
c) Phương pháp xác định vi khuẩn Salmonella (theo ISO:6579-2002)
Phương pháp xác định sự có mặt của vi khuẩn Salmonella được thực hiện theo qui trình sau:
Pha loãng mẫu theo bậc pha loãng thập phân: 10-1, 10-2,…10-4 ↓
Tăng sinh chọn lọc:
Cấy 1ml dung dịch pha loãng mẫu nồng độ 10-1
sang 10ml môi trường tăng sinh Muller Kauffman, ủ ở 370C/24h ↓
Phân lập và nhận diện: Cấy 0,1ml dịch tăng sinh
trên 2 môi trường chọn lọc XLT4 và BGA, ủ ở 370C/24h + Trên môi trường XLT4: Khuẩn lạc đen bóng, rìa gọn + Trên môi trường BGA: Khuẩn lạc màu hồng sáng
↓
Khẳng định bằng cách thử đặc tính sinh hóa:
- Cấy chuyển sang môi trường TSI: phần thạch nghiêng màu đỏ, thạch đứng màu vàng, sinh H2S, sinh hơi
- Thử nghiệm IMVC cho kết quả (- + - +) ↓
Kết luận: Phát hiện hay không phát hiện Salmonella