- không nhiễm + nhiễm
30 kgy <10 2 <10 2 <10 216 x105 A min 16 x 107 70 x 106 19 x 107 Nhiễ m vi n ấ m
A-45 min 10 x 106 60 x 106 78 x 106 12 x 107
A-60 min 60 x 105 12 x 106 20 x 106 21 x 106 P-2 hrs 12 x 107 27 x 107 25 x 107 35 x 107
28
A-45 min: khử trùng bằng autoclave, 45 phút A-60 min: khử trùng bằng autoclave, 60 phút P-2 hrs: phương pháp pasteur, 2 giờ P-4 hrs: phương pháp pasteur, 4 giờ P-6 hrs: phương pháp pasteur, 6 giờ - không nhiễm + nhiễm Tạo chế phẩm
Qui trình tạo chế phẩm trên nền chất mang cứng như sau:
- Chuẩn bị các túi đựng than bùn đã khử trùng (hoặc là nguồn chất mmang khác)
- Từ đường cong tiềm năng ẩm độ của chất mang, xác định số lượng sinh khối sẽ trộn vào than bùn đểđạt được ẩm độ thích hợp cho sự tồn tại của rhizobia trong chất mang đó.
- Làm sạch bề mặt của túi ở ngay vùng sẽ tiêm bằng cốn
- Sử dụng xy lanh và kim tiêm khử trùng, cẩn thận lấy lượng dịch sinh khối đã xác định cho vào trong túi chất mang, tránh dịch này tràn ra ngoài theo đường tiêm. Khử trùng vùng tiêm này bằng cồn và sau đó thì dán với nhãn dính với tên chủng và ngày tiêm.
- Cùng thời điểm đó, lấy một giọt dịch sinh khối đặt vào môi trường CRYMA, ria và ủ ở
nhiệt độ 30°C trong vài ngày. Kiểm tra tạp nhiễm trong dịch sinh khối.
- Xoa bóp nhẹ nhàng túi chế phẩm cho đến khi dịch sinh khối phân phối đều trong chất man, kiểm tra xem dịch sinh khối có phân bốđều ở 4 góc túi không.
- Ủ các túi chế phẩm ở nhiệt độ phòng từ 1–4 tuần
Công suất sản xuất qui mô nhỏ sử dụng than bùn/chất mang khử trùng có thể tăng lên bằng cách áp dụng klỹ thuật pha loãng dịch sinh khối. Chất lượng chế phẩm phụ thuộc vào chất lượng chất mang và chủng rhizobium
Bảng 21. Ảnh hưởng pha loãng dịch sinh khối đến số lượng rhizobia trong chế phẩm Số lượng rhizobia/g than bùn ẩm
Nghiệm thức (nguồn than bùn và múc độ pha loãng) Ban đầu 1 tuần 1 tháng 2 tháng 3 tháng 4 tháng 5 tháng 6 tháng Úc 40x107 21x108 25x108 31x108 24x109 15x108 17x108 23x108 Komix 38x107 42x108 34x108 28x108 60x108 55x108 17x108 12x108 DakNong 20x107 15x108 25x108 25x108 25x108 14x108 11x108 10x108 DakNong+pha loãng 1/5 10x10 7 20x108 12x108 10x108 11x108 10x108 10x108 12x108 DakNong+ pha loãng 1/10 65x10 6 21x108 14x108 10x108 13x108 15x108 90x107 10x108 DakNong+pha loãng 1/100 70x105 12x107 10x108 56x107 40x107 32x107 70x107 50x107 Nguồn: OPI Chủng Rhizobium: CB1809
Kết quả (Bảng 21 và 22) cho thấy pha loãng sinh khối 1:10 hoặc 1:100 có thể sử dụng tạo chế phẩm. Tuy nhiên cần thiết kiểm tra với mỗi loại than bùn và xác định nồng độ pha loãng nào là phù hợp.
Bảng 22. Ảnh hưởng dịch sinh khối pha loãng đến số lượng của rhizobia trong chế phẩm từ các chủng rhizobium khác nhau Số lượng rhizobia/g chế phẩm ẩm Chủng rhizobia 1: 1 1:10 1:100 1:1000 NC92 3,2 x 109 2,5 x 109 1,6 x 108 3,2 x 106 GL2 1,6 x 109 1,2 x 109 1,2 x 107 1,8 x 106 CB1809 6,5 x 109 7,4 x 109 5,8 x 109 1,5 x 106 SL2 6,6 x 109 3,4 x 108 1,4 x 107 1,6 x 105 Nguồn: ISF Sau hai tuần bảo quản Kiểm tra chất lượng sản phẩm
Sau 1- 2 tuần ủ, chế phẩm cần phải kiểm tra chất lượng, như sau:
• Kiểm tra ẩm độ (đối với chế phẩm trên nền chất mang rắn)
• Đếm số lượng rhizobia/g bằng phương pháp đếm trực tiếp và gián tiếp (MPN)
• Kiểm tra vi sinh vật tạp nhiễm
• Nhuộm gram từ khuẩn lạc từđếm trực tiếp
• Kiểm tra phản ứng kháng nguyên – kháng thể
Chỉ khi nào các kiểm tra này được thực hiện và chất lượng đạt chất blượng thì chế phẩm mới
đưa vào nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm đồng ruộng.
Qui trình QA: Hiện chưa có tiêu chuẩn dành riêng cho chế phẩm vi khuẩn nốt sần tại Việt nam, mà chỉ có tiêu chuẩn cho phân bón vi sinh vật cốđịnh đạm. Tuy nhiên, rất cần thiết để
có sự quản lý chất lượng (QA) hiệu quả cho chế phẩm. Đã cải tiến một số nội dung của tiêu chuẩn quôc gia Việt nam (TCVN 6166-1996), làm cho nó phù hợp hơn với chế phẩm rhizobium, dựa trên công nghệ sản xuất và các yêu cầu có hiệu quả. Tiêu chuẩn mới này sử
dụng cấu trúc tốt của tiêu chuẩn hiện tại.
Tên của tiêu chuẩn đề nghị là: Tiêu chuẩn Quốc gia Việt nam đối với Chế phẩm vi khuẩn nốt sần cho cây họđậu