tái sinh chồi Trầu tiên Yên Tử.

tái sinh chồi Trầu tiên Yên Tử.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng khoáng đến khả năng tái sinh mầm ngủ Trầu tiên Yên Tử.

3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Trầu tiên Yên Tử.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Trầu tiên Yên Tử

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Trầu tiên Yên Tử.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin kết hợp với GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi Trầu tiên Yên Tử.

3.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Trầu tiên Yên Tử.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của loài Trầu tiên Yên Tử.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ của loài Trầu tiên Yên Tử.

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

- Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung agar 5,5 g/l, đường saccharose 30 g/l, nước dừa 150 ml/l, inositol 100 mg/l, than hoạt tính 0,5 g/l; pH = 5,6-5,8.

- Môi trường B5 (Gamborg’s) bổ sung 30 g/l đường saccharose + 100 mg/l inositol + 5,5 g/l agar + 150 ml/l nước dừa + 0,5 g/l than hoạt tính; pH = 5,6-5,8.

- Môi trường WPM (Woody Plant Medium) bổ sung 30 g/l đường saccharose +100 mg/l inositol + 5,5 g/l agar + 150 ml/l nước dừa + 0,5 g/l than hoạt tính; pH = 5,6-5,8.

Các môi trường đều được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,0 atm từ 15-20 phút.

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu

Đoạn thân mang chồi ngủ

Khử trùng (cồn 70o, HgCl2)

Tái sinh chồi

Nhân nhanh chồi

Ra rễ tạo cây hoàn chinh

3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm

Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 30 bình, mỗi bình 1 mẫu.

3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu vô trùng đoạn thân Trầu tiên Yên Tử.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 và nồng độ của chúng đến khả năng tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng.

Các bước sẽ tiến hành vô trùng mẫu như sau:

- Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Mẫu cấy là các đoạn thân của cây Trầu tiên Yên Tử có mang mầm ngủ, đem rửa sạch dưới vòi nước, loại bỏ hết phần đất bẩn, cắt bỏ phần thừa, dùng xà phòng loãng để rửa, sau đó tráng lại bằng nước cất.

- Khử trùng mẫu: Tiến hành trong box cấy vô trùng, khử trùng sơ bộ bằng cồn

70° trong 30 giây, tráng lại 2-4 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó khử trùng tiếp bằng dung dịch HgCl2 để tiêu diệt nấm, vi khuẩn. Sau đó tráng lại bằng nước. Đặt mẫu lên đĩa cấy và để khô tự nhiên trong box. Sau đó dùng pank, dao, kéo cắt bỏ phần mẫu ngấm hoá chất trên mẫu và cấy vào môi trường nuôi cấy.

- Sau khi cấy xong đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 22 oC – 25oC, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm: 60 – 65% quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu.

Các công thức được bố trí như sau:

Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng loài Trầu tiên Yên Tử

Chỉ tiêu theo dõi: Tiến hành theo dõi sau 7 ngày các chi tiêu tỷ lệ mẫu sống không nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ mẫu chết.

3.4.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu thành phần môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Trầu tiên Yên Tử

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường khoáng đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân.

Mẫu sau khi khử trùng, sau một tuần theo dõi không bị nhiễm được cấy chuyển sang các môi trường nuôi cấy khác nhau với chất bổ sung 30 g/l đường saccharose + 100 mg/l inositol + 5,5 g/l agar + 150 ml/l nước dừa, để nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi Trầu tiên Yên Tử.

Công thức thí nghiệm được bố trí như sau:

CT Môi trường

1 Murashige & Skoog (MS)

2 Woody Plant Medium (WPM)

3 Gamborg’s (B5)

-Mẫu có kích thước tương đồng sau khi khử trùng được đưa vào môi trường tái sinh, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ tái sinh chồi và chất lượng chồi tái sinh sau 30 ngày nuôi cấy.

3.4.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Trầu tiên Yên Tử.

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Trầu tiên Yên Tử.

- Sử dụng môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin

là thành phần của môi trường MS bổ sung: đường 30 g/l + nước dừa 150 ml/l + agar 5,5 g/l + inositol 100 mg/l, pH = 5,6 - 5,8.

- Mẫu có kích thước tương đồng sau khi khử trùng được đưa vào môi trường nuôi cấy bề mặt, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi, quan sát chồi tái sinh và chất lượng chồi tái sinh.

Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + BA 1,0 mg/l CT 3: MT nền + BA 2,0 mg/l CT 4: MT nền + BA 3,0 mg/l CT 5: MT nền + BA 4,0 mg/l

Chỉ tiêu theo dõi: Tổng số mẫu bật chồi, hệ số nhân chồi và chất lượng chồi sau 20 ngày nuôi cấy.

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA (thích hợp nhất) ở thí nghiệm 3 kết hợp với Kinentin đến khả năng nhân nhanh chồi Trầu tiên Yên Tử.

Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A (nồng độ BA thích hợp nhất cho quá trình tái sinh chồi ở thí nghiệm 3) + Kinetin ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1(Đ/c): MT nền + A + Kinetin 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + Kinetin 0,5 mg/l CT 3: MT nền + A + Kinetin 1,0 mg/l CT 4: MT nền + A + Kinetin 1,5 mg/l CT 5: MT nền + A + Kinetin 2,0 mg/l

Chỉ tiêu theo dõi: Tổng số chồi thu được, hệ số nhân chồi và chất lượng chồi sau 20 ngày nuôi cấy.

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và Kinetin (thích hợp nhất) ở thí nghiệm 4 kết hợp với GA3 đến khả năng nhân nhanh chồi của loài Trầu tiên Yên Tử.

Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A + B (nồng độ Kinetin thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi đã xác định ở thí nghiệm 4) + GA3 ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + A + B + GA3 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + B + GA3 0,5 mg/l CT 3: MT nền + A + B + GA3 1,0 mg/l CT 4: MT nền + A + B + GA3 1,5 mg/l CT 5: MT nền + A + B + GA3 2,0 mg/l

Chỉ tiêu theo dõi: Tổng số chồi thu được, hệ số nhân chồi và hình thái chồi sau 20 ngày nuôi cấy.

3.4.3.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh Trầu tiên Yên Tử.

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của loài Trầu Tiên Yên Tử.

- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT nền có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng tạo rễ của mẫu.

- Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ. Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + NAA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + NAA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + NAA 1,0 mg/l CT 4: MT nền + NAA 1,5 mg/l CT 5: MT nền + NAA 2,0 mg/l

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu ra rễ, tỷ lệ mẫu ra rễ và chất lượng rễ sau 30 ngày nuôi cấy.

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng ra rễ của loài Trầu Tiên Yên Tử.

- Chồi sinh trưởng và có từ 2-3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT nền + B (nồng độ NAA thích hợp nhất cho ra rễ đã được xác định ở thí nghiệm

6) + THT ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng ra rễ của mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + B + THT 0,0 mg/l CT 2: MT nền + B +THT 0,5 mg/l

CT 3: MT nền + B + THT 1,0 mg/l CT 4: MT nền + B + THT 1,5 mg/l CT 5: MT nền + B + THT 2,0 mg/l

Chỉ tiêu theo dõi: Tổng số chồi ra rễ, số lượng rễ, tỷ lệ mẫu ra rễ và hình thái rễ sau 40 ngày nuôi cấy.

3.5. Các phương pháp xử lý số liệu

3.5.1. Thu thập số liệu

- Đếm số mẫu sống, mẫu nhiễm, mẫu chết.

- Đếm số chồi: Đếm tổng số chồi và nhánh trên một mẫu nuôi cấy ban đầu. - Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ.

3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi

-Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu:

+ Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm: Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) =

Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu)

× 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

+ Tỷ lệ mẫu sống nhiễm:

Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) =

+ Tỷ lệ mẫu chết:

Tổng số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết (%) =

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Chỉ tiêu theo dõi chồi:

Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) =

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng chồi thu được Hệ số nhân chồi (lần) =

Tổng chồi nuôi cấy Hình thái chồi:

+ Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh

+ Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt + Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng

- Chỉ tiêu theo dõi ra rễ:

Tổng số chồi ra rễ (chồi) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) =

Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu) Hình thái rễ:

+ Rễ tốt: Rễ khỏe, dài.

+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn. + Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ.

3.5.3. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm Microsoft office Excel 2010 và phần mềm IRRISTAT 5.0.

Phần 4

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu vô trùng đoạn thân Trầu tiên Yên Tử.

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, vô trùng mẫu cấy la giai đoạn khởi đầu va quyết định sự thanh công của quá trình nuôi cấy. Đây la giai đoạn tạo nguôn nguyên liệu ban đầu cho các quá trình nhân giống tiếp theo. Nếu như bươc tái sinh mẫu không thành công thì quy trình nhân giống in vitro cũng không thể tiến hành. Để tiến hành tái sinh mẫu trươc hết cần phai tiến hành khư

trùng mẫu cho phù hơp vơi từng loại đối tương cũng như từng loại mẫu khác nhau. Để có đươc vât liệu khởi đầu sạch nấm và vi khuân, việc lựa chon chất khư

trùng, nông độ và thơi gian rất quan trong. Qua quá trình nghiên cưu và tìm hiểu kha năng tạo mô sạch trong nuôi cấy in vitro trên đối tương khác nhau, chúng tôi nhân thấy có nhiêu chất hóa hoc có hoạt tính diệt nấm và vi khuân mạnh như Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2), hydroxid (H2O2),....Tuy nhiên HgCl2

đươc nhiêu nhà

nghiên cưu sư dung bởi chúng có hoạt tính khư trùng tốt, cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao [6]. Nguôn mẫu loài Trầu Tiên Yên Tư đưa vao nuôi cấy trong các thí nghiệm lấy từ các đoạn thân mang chôi ngủ thu thâp ngoai tự nhiên nên chưa rất nhiêu loại vi sinh vât. Vì vây, cần lựa chon đươc nông độ, thơi gian khư trùng thích hơp nhất để loại bo hoàn toàn mầm bệnh khoi mẫu

trươc khi đưa vào môi trương nuôi cấy tạo vât liệu ban đầu sạch nấm, sạch vi khuân. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm HgCl₂ ở các nông độ và thơi gian khác nhau. Sau 7 ngày theo dõi kết qua thu đươc trình bày ở bang sau:

Bảng 4.1.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của HgCl2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy)

Công thức CT 1(Đ/c) CT 2 CT 3 HgCl2 CT 4 CT 5 CT 6 HgCl2 CT 7 CT 8 CT 9 HgCl2 CT 10

Ghi chú: *: CT có sự sai khác ý nghĩa so với đối chứng

Từ kết quả ở bảng 4.1 cho thấy:

Ở chi tiêu mẫu sống không nhiễm: Với giá trị LSD05 đạt 1,85; Các công thức thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa với công thức đối chứng (sử dụng nước cất hấp vô trùng). Hiệu quả khử trùng đạt giá trị cao nhất 68,89% ở CT9 (nồng độ HgCl2

0,2% xử lý trong 10 phút). Tuy nhiên ở CT3 và CT10 với nồng độ và thời gian khử trùng lần lượt là 0,1% và 10 phút; 0,2% và 15 phút không có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều đó cho thấy tỷ lệ mẫu sống không nhiễm ảnh hưởng rất lớn của nồng độ và thời gian khử trùng. Nếu nồng độ thấp, tỷ lệ mẫu nhiễm cao còn nếu nồng độ cao thì tỷ lệ mẫu chết tăng. Vì vậy, cả hai đều ảnh hưởng đến tỷ lệ mẫu sống không nhiễm.

chi tiêu diệt nấm và vi khuẩn mà còn ảnh hưởng đến sức sống và sinh trưởng phát triển của mẫu sau khi xử lý vô trùng.

Do đó trong quá trình vô trùng vật liệu cần lựa chọn được loại hoá chất, nồng độ và thời gian phù hợp để giảm tỷ lệ chết. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, CT9 được lựa chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo vì đảm bảo tiêu chí tỷ lệ sống không nhiễm cao, tỷ lệ chết thấp, tỷ lệ mẫu sống nhiễm thấp cụ thể là 68,89%; 11,11%; 22,22%.

Hình 4.1: Một số hình ảnh mẫu cấy trước khi tạo vật liệu vô trùng.

4.2. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường dinh dưỡng khoáng đến khả năng tái sinh chồi Trầu tiên Yên Tử.

Mẫu sau khi xử lí vô trùng, sau 1 tuần theo dõi không bị nhiễm được cấy chuyển sang các môi trường dinh dưỡng có chứa các thành phần khoáng khác nhau để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tái sinh chồi loài Trầu tiên Yên Tử. Chúng tôi thu được kết quả ở bảng sau:

Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi loài Trầu tiên Yên Tử (sau 30 ngày nuôi cấy)

Công Môi

thức trường

CT 1 MS

CT 2 B5

CT 3 WPM

Ghi chú: MS: Murashige & Skoog, WPM: Woody Plant Medium, B5: Gamborg’s

Từ bảng 4.2 cho thấy:

Ở chi tiêu tỷ lệ tái sinh chồi: Giá trị LSD05 đạt 4,35 và CV (%): 4,2%.; Các công thức đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy là 95%. CT1 (MS) cho tỷ lệ chồi tái sinh cao nhất 66,67%. Tiếp theo CT2 (B5) tỷ lệ tái sinh chồi là 46,67%. CT3 cho tỷ lệ tái sinh chồi thấp nhất 23,33%.

Ở chi tiêu hình thái chồi: CT3 (WPM) chồi thu được có màu xanh nhạt và gầy.

CT2 là môi trường B5 chồi thu được có màu xanh nhạt và mập. Trên môi trường MS cho tỷ lệ tái sinh cao nhất trong thí nghiệm trên quan sát và thu được chồi có