Kết quả nghiên cứu hình thái lá - Đánh giá đa dạng- 123docz.net

Trong nghiên cứu này, đánh giá các đặc điểm về số lá, kích thước lá, màu sắc lá của các mẫu sả. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.4. và hình 4.3.

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu hình thái lá

Mẫu (ký hiệu) Số lá (lá) Chiều dài phiến lá (cm) Chiều rộng phiến lá (cm) Đặc điểm phiến lá Màu sắc lá SAN

7,7b 90,2a 2,1a Phiến lá to Xanh đậm

SHN

9,3a 103,5a 1,5b Phiến lá nhỏ Xanh nhạt

SĐL

9,0a 101,2a 1,6b Phiến lá nhỏ Xanh nhạt

SBS

6,3c 79,0b 1,4b Phiến lá nhỏ Xanh nhạt

SBD

6,3c 77,2b 1,4b Phiến lá nhỏ Xanh nhạt

SATT

5,7c 62,1c 1,3b Phiến lá nhỏ Xanh nhạt

STH

7,3b 92,2a 2,2a Phiến lá to Xanh đậm

SAX

7,7b 89,9a 2,3a Phiến lá to Xanh đậm

CV%

9,92 6,12 2,50

LSD0,05

1,27 9,21 0,07

SHN SĐL STH SAN SAX SBS SBD SATT

Hình 4.3. Kết quả nghiên cứu hình thái lá

Kết quả thể hiện tại bảng 4.4 và hình 4.3 ta thấy:

Số lá sả sau 6 tháng trồng phát triển giao động từ 5,7 lá đến 9,3 lá, cụ thể: Mẫu sả SHN có số lá lớn nhất là 9,3 lá, mẫu sả SĐL có số lá là 9,0 lá, hai mẫu sả SAN và SAX đều có số lá là 7,7 lá, mẫu sả STH có số lá là 7,3 lá, hai mẫu sả SBS và SBD đều có số lá là 6,3 lá, mẫu sả SATT có số lá nhỏ nhất chỉ 5,7 lá. Chiều dài phiến lá sả sau 6 tháng trồng phát triển giao động từ 62,1 cm đến 103,5 cm, cụ thể: Mẫu sả SHN có chiều dài phiến lá lớn nhất là 103,5 cm, mẫu sả SĐL có chiều dài phiến lá là 101,2 cm, mẫu sả SĐL có chiều dài phiến lá là 101,2 cm, mẫu sả STH có chiều dài phiến lá là 92,2 cm, mẫu sả SAN có chiều dài phiến lá là 90,2 cm, mẫu sả SAX có chiều dài phiến lá là 89,9 cm, mẫu sả SBS có chiều dài phiến lá là 79,0 cm, mẫu sả SBD có chiều dài phiến lá là 77,2 cm, mẫu sả SATT có chiều dài phiến lá nhỏ nhất là 62,1 cm. Chiều rộng phiến lá sả sau 6 tháng trồng phát triển giao động từ 1,3 cm đến 2,3 cm, cụ thể: Mẫu sả SAX có chiều rộng phiến lá lớn nhất là 2,3 cm, mẫu sả STH có chiều rộng phiến lá là 2,2 cm, mẫu sả SAN có chiều rộng phiến lá là 2,1 cm, mẫu sả SĐL có chiều rộng phiến lá là 1,6 cm, mẫu sả SHN có chiều rộng phiến lá là 1,5 cm, hai mẫu sả SBS

và SBD có chiều rộng phiến lá là 1,4 cm, mẫu sả SATT có chiều rộng phiến lá nhỏ nhất là 1,3 cm. Các mẫu sả SAN, STH, SAX có phiến lá to; các mẫu sả SHN, SĐL, SBS, SBD, SATT đều có phiến lá nhỏ. Các mẫu sả SAN, STH, SAX có lá màu xanh đậm; các mẫu sả SHN, SĐL, SBS, SBD, SATT có lá màu xanh nhạt. Các mẫu sả thu thập có chiều dài phiến lá dài hơn giống sả Cymbopogon citrates là 90 cm, chiều rộng phiến lá các mẫu sả gần như tương đồng với giống sả Cymbopogon citrates có chiều rộng phiến lá từ 1,3-2,5cm theo công bố của Gagan Shah và cs (2011) [28].

4.2.4. Kết quả nghiên cứu tạo sinh khối các mẫu sả

Trong nghiên cứu này, đánh giá sinh khối của các mẫu sả. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.5.

Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu tạo sinh khối các mẫu sả

Mẫu Trung bình (gam)

SAN 319,3c SHN 516,3a SĐL 411,3b SBS 213,3c SBD 260,7c SATT 211,3c STH 416,3b SAX 421,7b CV% 10,0 LSD0,05 60,4

(Ghi chú: a, b, c là các nhóm sai khác có ý nghĩa với mức ý nghĩa α = 0,05)

Kết quả thể hiện tại bảng 4.5 ta thấy:

Mẫu sả SHN có giá trị trung bình của tổng sinh khối lớn nhất là 516,3 gam. Mẫu sả SAX có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 421,7 gam. Mẫu sả STH có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 416,3 gam. Mẫu sả SĐL có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 411,3 gam. Mẫu sả SAN có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 319,3

gam. Mẫu sả SAX có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 260,7 gam. Mẫu sả SBS có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 213,3 gam. Mẫu sả SATT có giá trị trung bình của tổng sinh khối nhỏ nhất là 211,3 gam.

4.3. Kết quả nghiên cứu hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả

Trong nghiên cứu này, đánh giá hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.6.

Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả

Mẫu Trung bình (µl) SAN 688,33a SHN 498,33c SĐL 521,67b SBS 471,67d SBD 458,33d SATT 431,67e STH 701,67a SAX 686,67a CV% 2,02 LSD0,05 19,51

(Ghi chú: a, b, c là các nhóm sai khác có ý nghĩa với mức ý nghĩa α = 0,05)

Kết quả thể hiện tại bảng 4.6 ta thấy:

Mẫu sả STH có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số lớn nhất là 701,67µl. Mẫu sả SAN có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 688,3µl. Mẫu sả SAN có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 686,7µl. Mẫu sả SĐL có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 521,7µl. Mẫu sả SHN có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 498,3µl. Mẫu sả SBS có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 471,7µl. Mẫu sả SBD có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 458,3µl. Mẫu sả SATT có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số nhỏ nhất là 431,7µl. Kết quả của thí nghiệm này thấp hơn kết quả đánh giá của

Trần Ngọc Sang (2018) là 140 – 250 ml/4kg hay Nguyễn Thành Phương (2020) là 15,5 ml/3kg [10], [9].

4.4. Kết quả tối ưu quy trình tách DNA từ các mẫu

4.4.1. Kết quả ảnh hưởng thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol trong quá trình tách mẫu

Trong nghiên cứu này, đánh giá thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol với các mẫu sả. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.7.

Bảng 4.7. Tỷ lệ mẫu hiện DNA khi thực hiện thí nghiệm thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol trong quá trình tách mẫu

Công thức thí nghiệm Thời gian (phút) Số mẫu ban đầu (mẫu)

Chỉ tiêu đánh giá Số mẫu hiện DNA (mẫu) Tỷ lệ số mẫu hiện DNA (%) Chất lượng băng CT1(đc) 0 8 0.0d 0 0 CT2 5 8 3,7c 46,25 1 CT3 10 8 6.3b 78,75 2 CT4 15 8 7,3a 91,25 3 CV% 11,53 LSD0,05 0,86

(Ghi chú: a, b, c là các nhóm sai khác có ý nghĩa với mức ý nghĩa α = 0,05)

Ghi chú : - 0 : không có băng.

- 1 : băng sáng mờ, DNA không có nhiều trong băng. - 2 : băng sáng gọn, DNA có nhiều trong băng. - 3 : băng sáng phình to, DNA đứt gẫy.

Kết quả thu được ở bảng 4.7 cho thấy : CT1 không có thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohoL nên không có mẫu hiện DNA. CT2 sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol với thời gian 5 phút đã có tỷ lệ mẫu hiện DNA là 3,7 mẫu, tỷ lệ phần trăm so với số mẫu ban đầu là 46,25%, băng mờ gọn nhưng DNA không có nhiều trong băng. CT3 khi tăng thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol lên 10 phút có số mẫu hiện DNA là 6,3 mẫu có tỷ lệ hiện DNA là 78,75% băng sáng

gọn DNA có nhiều trong băng. Ở CT4 có thời gian là 15 phút, tỷ lệ mẫu hiện DNA cao nhất đạt 7,3 mẫu, có tỷ lệ hiện DNA 91,25 % băng sáng phình to nhưng DNA bị đứt gẫy. Công thức 4 số mẫu hiện DNA giảm rõ rệt khi nâng thời gian sử dụng lên 12 phút với số mẫu hiện DNA còn 10,05 mẫu, cho tỷ lệ hiện mẫu chỉ còn 35%. Từ số liệu trên bảng, ta thấy rằng thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol hợp lý nhất là 10 phút.

4.4.2. Kết quả ảnh hưởng số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol trong quá trình tách mẫu

Trong nghiên cứu này, đánh giá số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol với các mẫu sả. Kết quả được thể hiện trong bảng 4.8.

Bảng 4.8. Tỷ lệ mẫu hiện DNA khi thực hiện thí nghiệm số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol trong quá trình tách mẫu

Công thức thí nghiệm Số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol (lần) Thời gian (phút) Số mẫu ban đầu (mẫu)

Chỉ tiêu đánh giá

Số hiện DNA (mẫu) Tỷ lệ số hiện DNA (%) Chất lượng băng CT1(đc) 0 10 8 0c 8 0 CT2 1 8 4,67b 58,37 1 CT3 2 8 7,33a 91,62 2 CT4 3 8 7,67a 95,87 3 CV% 10,16 LSD0,05 0,86

(Ghi chú: a, b, c là các nhóm sai khác có ý nghĩa với mức ý nghĩa α = 0,05) Ghi chú : - 0 : không có băng.

- 1 : băng mờ gọn, DNA không có nhiều trong băng. - 2 : băng sáng gọn, DNA có nhiều trong băng. - 3 : băng sáng phình to, DNA đứt gẫy.

Qua bảng 4.8 ta thấy:

Khi sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol với thời gian 10 phút. CT1 không có số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl alcoho nên không có mẫu hiện DNA. CT2 có số mẫu hiện DNA trong thí nghiệm là 4,67 mẫu với tỷ lệ hiện mẫu là 58,37% băng mờ gọn nhưng ít DNA trong băng. Khi tăng số lần sử dụng lên 2 lần ở CT3 các mẫu hiện DNA có xu hướng tăng, cụ thể là số mẫu hiện DNA là 7,33 mẫu với tỷ lệ mẫu hiện DNA là 91,62% có băng sáng gọn có nhiều DNA trong băng. CT4 số mẫu hiện DNA là 7,67 mẫu với tỷ lệ 95,87% tuy nhiên băng sáng phình to DNA đứt gẫy nhiều. Trong khuôn khổ thí nghiệm này công thức 3 sử dụng 2 lần phenol chloroform isoamyl alcohol cho số lượng mẫu hiện DNA tốt nhất.

4.4.3. Kết quả phương pháp tách chiết DNA tổng số từ các mẫu sả và điện di trên gel.

Để đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu sả nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử, các mẫu lá sả thu thập được tách chiết DNA tổng số bằng phương phương pháp của Dolye và Dolye (1987) có một vài biến đổi nhỏ để phù hợp hơn với phòng thí nghiệm [17]. Mẫu tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số được thể hiện trong hình 4.4.

SAX STH SATT SBD SBS SĐL SHN SAN M

Hình 4.4. Kết quả phương pháp tách chiết DNA tổng số từ các mẫu sả và điện di trên gel.

các đường chạy từ 1-8: các mẫu DNA tổng số

Kết quả điện di cho thấy, các đường chạy đều cho một số băng DNA sáng (SAN, SHN, SĐL, SN, SATT, SAX) và một số băng mờ (SBS, STH), không có băng phụ chứng tỏ đã tách chiết được DNA tổng số của các mẫu sả nghiên cứu, sản phẩm DNA không bị đứt gãy, hàm lượng cao, đủ điều kiện để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo. Các dung dịch DNA tổng số được bảo quản ở -20oC phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.

4.5.Kết quả lựa chọn các cặp mồi đánh giá đa dạng di truyền cây sả.

Trong các thí nghiệm về đánh giá đa dạng di truyền sử dụng phương pháp RAPD có rất nhiều các cặp mồi khác nhau được sử dụng và cho ra các kết quả rất tốt. Trong quá trình nghiên cứu các tài liệu tham khảo phục vụ thí nghiệm, thấy rằng cặp mồi OPA04 được sử dụng trong đề tài “Khảo sát sự đa dạng di truyền của một số mẫu nghệ ở miền nam Việt Nam dựa trên chỉ thị phân tử RAPD và ISSR” [4] cho băng hiện rõ nét. Cặp mồi OPA08 và OPA12 được sử dụng trong đề tài “Đa dạng sinh học một số loài lan rừng thuộc chi Dendrobium bằng kỹ thuật RAPD” [8] cho chất lượng băng rõ nét. Cặp mồi OPB10 và OPF09 được sử dụng trong đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền một số dòng, mẫu hoa chi Lan Huệ (Hippeastrum herb.) bằng chỉ thị phân tử RAPD” [3] cho chất lượng băng rõ nét. Cặp mồi OPA12, OPB17, OPC1, OPC2, OPC5 trong đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền các loài quế Thanh Hóa bằng chỉ thị RAPD” [13]. Cặp mồi OPB07 trong đề tài “ Đánh giá đa dạng di truyền cho một số mẫu cúc (Chrysanthemun spp.) ở miền Nam” [12] cho chất lượng băng rõ nét. Căn cứ vào các kết quả trên, nhận thấy việc sử dụng các cặp mồi OPA04, OPA08, OPA12, OPB07, OPB10, OPB17, OPC1, OPC2, OPC5, OPF09 phù hợp phục vụ các thí nghiệm trong khóa luận.

4.6. Kết quả phương pháp PCR - RAPD và xây dựng cây phân loại

4.6.1. Kết quả phương pháp PCR - RAPD

4.6.1.1. Mẫu sả SAN

Hình 4.5: Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SAN

Ghi chú:

M: Marker 1: OPA04 2: OPA08 3: OPA12 4: OPB07 5: OPB10 6: OPB10

7: OPB17 8: OPC1 9: OPC2 10: OPC5

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mẫu sả SAN được thể hiện trong hình 4.5 cho thấy, với mẫu sả SAN có 7 cặp mồi gồm OPA04, OPA12, OPB07, OPB10, OPB17, OPC2, OPC5 có hình thành sản phẩm. Trong đó, cặp mồi OPA04 hình thành 1 band DNA có kích thước 500bp. Cặp mồi OPA12 hình thành 2 band có kích thước 1000bp và 15000bp. Cặp mồi OPB07 và cặp mồi OPB10 hình thành 1 band DNA có kích thước 1000bp. Cặp mồi OPB17 hình thành 2 band có kích thước 1000bp và 1500bp. Cặp mồi OPC2 và cặp mồi OPC5 hình thành 1 band DNA có kích thước 3000bp. Các mồi còn lại không xuất hiện băng DNA vậy mẫu sả SAN không thể hiện tính đa hình với các mồi trên.

4.2.3.2. Mẫu sả SHN

Hình 4.6: Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SHN

Ghi chú:

M: Marker 1: OPA04 2: OPA08 3: OPA12 4: OPB07 5: OPB10 6: OPB10

7: OPB17 8: OPC1 9: OPC2 10: OPC5

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mẫu sả SHN được thể hiện trong hình 4.6 cho thấy, với mẫu sả SHN có 10 cặp mồi hình thành sản phẩm PCR gồm OPA04, OPA08, OPA12, OPB07, OPB10, OPB17, OPC1, OPC2, OPC5, OPF09. Trong đó, cặp mồi OPA04 hình thành 1 band DNA có kích thước 1000bp. Cặp mồi OPA08 hình thành 2 band DNA có kích thước 1000bp và 3000bp. Cặp mồi OPA12, OPB07, OPC5 hình thành 2 band DNA có kích thước 500bp và 1000bp . Cặp mồi OPB10, OPC1 và OPF09 hình thành 1 band DNA có kích thước 1000bp. Cặp mồi OPC2 hình thành 4 band có kích thước 500bp, 1000bp, 3000bp, 4000bp. Các cặp mồi còn lại không xuất hiện băng DNA do đó không thể hiện tính đa hình với mẫu nghiên cứu trên.

4.2.3.3. Mẫu sả SĐL

Hình 4.7. Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SĐL

Ghi chú:

M: Marker 1: OPA04 2: OPA08 3: OPA12 4: OPB07 5: OPB10 6: OPB10

7: OPB17 8: OPC1 9: OPC2 10: OPC5

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mẫu sả SĐL được thể hiện trong hình 4.7 cho thấy, với mẫu sả SĐL có 8 cặp mồi hình thành sản phẩm PCR gồm các cặp mồi OPA04, OPA12, OPB07, OPB17, OPC1, OPC2, OPC5, OPF09. Trong đó, cặp mồi OPA04 hình thành 1 band DNA có kích thước 900bp. Cặp mồi OPA12 hình thành 2 band DNA có kích thước 700bp và 2000bp. Cặp mồi OPB07 hình thành 1 band DNA có kích thước 650bp. Cặp mồi OPB17 và OPC1 hình thành 2 band có kích thước 630bp và 4000bp. Cặp mồi OPC2 hình thành 2 band DNA có kích thước 620bp và 3500bp. Cặp mồi OPC5 hình thành 2 band DNA có kích thước 600bp và 3000bp. Cặp mồi OPF09 hình thành 1 band DNA có kích thước 2500bp. Các cặp mồi còn lại không xuất hiện băng DNA do đó không thể hiện tính đa hình với mẫu nghiên cứu trên.

4.2.3.4. Mẫu sả SBS

Hình 4.8. Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SBS

Ghi chú:

M: Marker 1: OPA04 2: OPA08 3: OPA12 4: OPB07 5: OPB10 6: OPB10

7: OPB17 8: OPC1 9: OPC2 10: OPC5

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng mẫu sả SBS được thể hiện trong hình 4.8 cho thấy, với mẫu sả SBS có 8 cặp mồi hình thành sản phẩm PCR gồm OPA04, OPA12, OPB07, OPB10, OPB17, OPC2, OPC5, OPF09. Trong đó, cặp mồi OPA04 hình thành 2 band DNA có kích thước 260bp và 550bp . Cặp mồi OPA12 hình thành 2 band DNA có kích thước 300bp và 500bp. Cặp mồi OPB07 hình thành 2 band DNA có kích thước 850bp và 2000bp. Cặp mồi OPB10 hình thành 2 band DNA có kích thước 600bp và 2500bp. Cặp mồi OPB17 hình thành 3 band DNA có kích thước 450bp, 700bp, 2600bp. Cặp mồi OPC2 hình thành 3 band có kích thước 500bp, 600bp, 2600bp. Cặp mồi OPC5 hình thành 2 band có kích thước 500bp và