CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.5.2. Phương pháp thu nhận alginate lyase từ chủng vi khuẩn tuyển
theo [85].
2.3.5.2. Phương pháp thu nhận alginate lyase từ chủng vi khuẩn tuyểnchọn chọn
Dịch enzyme ngoại được tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp tủa với muối (NH4)2SO4. Đây thường là bước đầu tiên để tinh sạch alginate lyase từ vi khuẩn biển [85], cụ thể như sau: Dịch chiết thô enzyme được tủa phân đoạn với (NH4)2SO4 80%. Thực hiện kết tủa trong 24 giờ ở 4oC, sau đó li tâm 30 phút ở nhiệt độ 10oC, 12.000rpm và thu nhận phần tủa. Sau đó phần kết tủa được huyền phù lại trong 20ml đệm 20 mM Tris-HCl, pH 7,5. Thẩm tách dịch huyền phù qua màng thẩm tách 10kDa trong đệm, ở nhiệt độ 4oC, qua đêm để loại muối (NH4)2SO4.
Thử nghiệm hoạt tính enzyme: Hỗn hợp phản ứng gồm 100 µl enzyme đã pha lỗng ở nồng độ 0,1 mg protein/ml và 1900µl S. mcc A nồng độ 10mg/ml pha trong đệm 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 và 200 mM NaCl. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC trong 30 phút. Sau đó, dừng phản ứng bằng cách thêm 20 µl NaOH 10M. Ghi nhận bước sóng 235 tại thời điểm 0 phút và 30 phút. Hoạt tính alginate lyase được tính bằng sự gia tăng bước độ hấp thụ ở bước sóng OD235 [3]. Một đơn vị hoạt tính (U) được xác định là lượng enzyme cần thiết để gia tăng độ hấp thụ tại bước sóng 235 nm lên 0,1 trong 1 phút.
Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry[85] với chuẩn là albumin.
+ Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N + Dung dịch B: NaK Tartrate 1% trong nước cất + Dung dịch C: CuSO4.5H2O 0,5% trong nước cất
- Lấy 0,5ml dung dịch mẫu chứa protein với hàm lượng thích hợp, thêm vào đó 2ml dung dịch D (48ddA:1ddB:1ddC), lắc đều để yên trong 10 phút, sau đó thêm vào hỗn hợp 0,25ml Folin đã pha lỗng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, màu vàng của hỗn hợp chuyển sang màu xanh da trời và đạt đến cường độ cực đại. Đo mật độ quang hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 660 nm. Dùng Albumin huyết thanh bị (BSA) để xây dựng đường chuẩn (Hình