Phương pháp tổng hợp vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Phương pháp tổng hợp vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Phương pháp tổng hợp vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate

Trong luận văn, vật liệu nano Cu2O-Cu được tổng hợp bằng cách sử dụng tiên chất là CuSO4.5H2O, chất khử là hydrazin hydrate và chất ổn định là alginate tham khảo theo quy trình tổng hợp nghiên cứu trước đây của nhóm tác giả Bùi Duy Du và cộng sự (2019) [58]. Quy trình tổng hợp 250 mL vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được trình bày trong hình 2.1, gồm các công đoạn sau:

Công đoạn 1: Tạo phức Cu2+ với dung dịch NH3.

Cân 5 g CuSO4.5H2O hịa tan hồn tồn trong 5 mL nước thu được dung dịch CuSO4. Sau đó thêm 5,5 mL dung dịch NH3 25% vào dung dịch CuSO4 để tạo phức [Cu(NH3)4]2+ nhằm tránh việc tạo gel giữa Cu2+ và alginate.

Công đoạn 2: Chuẩn bị dung dịch alginate/phức [Cu(NH3)4]2+.

Cân 12,5 g alginate hòa tan trong 225 mL nước, khuấy gia nhiệt ơ 60°C trong 2 giờ thu được dung dịch alginate. Sau đó cho dung dịch phức [Cu(NH3)4]2+ vào dung dịch alginate, tiếp tục khuấy trong 10 phút để hỗn hợp đồng nhất thu được hỗn hợp dung dịch alginate/phức [Cu(NH3)4]2+.

Công đoạn 3: Khử Cu2+ thành Cu+ và Cu°.

Thêm từng giọt 9 mL dung dịch chất khử hydrazin (N2H4 8%) vào cốc đựng hỗn hợp dung dịch alginate/phức [Cu(NH3)4]2+, khuấy trên máy khuấy từ. Trong quá trình này sẽ xảy ra phản ứng khử Cu2+ thành Cu+ và Cu° có kích

thước nano ổn định trong alginate. Sau khi cho hết dung dịch chất khử hydrazin 8%, tiếp tục khuấy trong khoảng 1 giờ để phản ứng khử xảy ra hoàn tồn.

Cơng đoạn 4: Thêm 2,5 g PEG vào dung dịch keo nano Cu2O-

Cu/alginate, khuấy trong 1 giờ thu được vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate. Tổng thể tích của hỗn hợp phản ứng được điêu chỉnh thành 250 mL bằng cách thêm nước khử ion.

Hình 2.1. Quy trình tổng hợp vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate2.2.2. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 2.2.2. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

TEM là một kỹ thuật hiển vi trong đó dịng điện tử đi xun qua một màng mỏng của mẫu đo và tương tác với nó. Một hình ảnh được tạo thành từ sự tương tác của điện tử đi xuyên qua mẫu đo, hình ảnh này được phóng đại và tập trung lên một thiết bị nhận ảnh như là màn hình huỳnh quang (fluorescent screen) hay lớp phim nhằm xác định kích thước hạt nano Cu2O- Cu/alginate.

Vê mặt lý thuyết, độ phân giải cực đại d nhận được từ ánh sáng bị giới hạn bơi bước sóng của các photon được dùng để quan sát mẫu.

Alginate CuSO4.5H2O H2O DD phức [Cu(NH3)4]2+ Phản ứng khử H2O DD NH3 DD N2H4

PEG DD keo nano Cu2O-Cu/alginate

λ d =

2nsinα

Hiện nay, độ phân giải của kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả kiến với bước sóng tương đối lớn từ 400 – 700 nm bằng cách dùng chùm điện tử (electron bean). Theo lý thuyết Broglie, các điện tử vừa có tính chất sóng vừa có tính chất hạt. Điêu này có nghĩa là chùm điện tử có thể đóng vai trị như là chùm bức xạ điện từ. Bước sóng của điện tử liên hệ với động năng thông qua phương trình Broglie.

h λ0 ≈ Trong đó: h: Hằng số Planck √2m 0 E(1 + E 2m0c2

mo: Khối lượng tịnh của điện tử

E: Năng lượng của electron được tăng tốc

Các điện tử được tạo ra thông qua sự phát xạ ion nhiệt từ một dây tóc làm bằng tungsten. Các điện tử này được tăng tốc bằng một điện trường (được tính bằng volt). Các điện tử khi đi qua mẫu chứa đựng những thông tin vê mật độ điện tử, pha cấu trúc tinh thể, dòng điện tử này dùng để tạo hình ảnh.

Tiến hành: Pha lỗng dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate đến nồng độ

thích hợp và đánh tan bằng máy siêu âm trong 10 phút. Sử dụng pipet nhỏ 1 – 2 giọt dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate đã pha lỗng lên bê mặt đế mẫu. Sấy khơ và tiến hành chụp ảnh TEM trên thiết bị đo TEM – JEM 1400 tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương có các thơng số M = x50 – x600.000, d=3A0, U= 40 – 100 kV.

2.2.3. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)

Phương pháp XRD dựa vào hiện tượng nhiễu xạ của chùm tia X trên mạng lưới tinh thể. Khi bức xạ tia X tương tác với vật chất sẽ tạo hiệu ứng tán xạ đàn hồi với các điện tử của các nguyên tử trong vật liệu có cấu trúc tinh thể, sẽ dẫn đến hiện tượng nhiễu xạ tia X.

Theo lý thuyết cấu tạo tinh thể, mạng tinh thể được xây dựng từ các nguyên tử hay ion phân bố đêu trong không gian theo một trật tự nhất định. Khi

chùm tia X chiếu tới bê mặt tinh thể và đi sâu vào bên trong mạng lưới tinh thể thì mạng lưới này đóng vai trị như một cách tử nhiễu xạ đặc biệt. Các nguyên tử hoặc ion bị kích thích bơi chùm tia X sẽ thành các tâm phát ra các tia phản xạ. Mặt khác, các nguyên tử hoặc ion này được phân bố trên các mặt phẳng song song.

Mối liên hệ giữa khoảng cách hai mặt nhiễu xạ song song (dhkl), góc giữa chùm tia X và mặt phẳng phản xạ (θ) với bước sóng (λ) được biểu thị bằng hệ phương trình Vulf – Bragg:

2dhklsin θ = nλ

Đây là phương trình cơ bản để nghiên cứu cấu trúc tinh thể. Căn cứ vào cực đại nhiễu xạ trên giản đồ (giá trị 2) có thể suy ra d theo cơng thức trên. So sánh giá trị d tìm được với giá trị d chuẩn sẽ xác định được cấu trúc mạng tinh thể chất cần nghiên cứu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Kích thước của hạt được tính theo phương trình Scherrer như sau: d = 0,9.λ/[β1/2.cosθ]

Trong đó:

λ: độ dài bước sóng của bức xạ Cu Kα (λ =1,5406) β1/2: độ bán rộng vạch nhiễu xạ

θ: góc Brag

Tiến hành: Dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate được kết tủa với etanol

90%, tỷ lệ Vetanol/Vdung dịch vật liệu = 2/1, lọc và rửa kết tủa 3 lần bằng etanol 70%, sấy chân không ơ nhiệt độ 60°C thu được mẫu vật liệu dạng bột. Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được đo phổ XRD trên thiết bị đo D8 Advance (Bruker) dùng bức xạ của Cu Kα, λ = 1.5406 Ao, khoảng quét 2θ = 1 – 70o.

2.2.4. Phương pháp đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR)

Chùm tia hồng ngoại phát ra từ nguồn phát được tách ra thành hai phần, một phần đi qua mẫu và một phần đi qua môi trường đo – tham chiếu (dung môi) rồi được bộ phận tạo đơn sắc tách thành từng bức xạ có tần số khác nhau và chuyển đến detector. Detector sẽ so sánh cường độ hai chùm tia và chuyển thành tín hiệu điện có cường độ tỷ lệ với phần bức xạ đã bị hấp thu bơi mẫu. Dịng điện này có cường độ rất nhỏ nên phải nhờ bộ khuếch đại tăng lên

nhiêu lần trước khi chuyển sang bộ phận tự ghi vẽ lên bản phổ hoặc đưa vào máy tính xử lý số liệu rồi in ra phổ.

Phương pháp FT-IR được sử dụng để ghi nhận các dao động đặc trưng của các liên kết hóa học giữa các nguyên tử. Phương pháp này cho phép phân tích với hàm lượng chất mẫu rất thấp và có thể phân tích cấu trúc, định tính và cả định lượng. Các đỉnh phổ hồng ngoại đặc trưng cho nhóm chức được gán với các dao động của liên kết có mặt trong phân tử hợp chất hoá học.

Tiến hành: Dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate được kết tủa với etanol

90%, tỷ lệ Vetanol/Vdung dịch vật liệu = 2/1, lọc và rửa kết tủa 3 lần bằng etanol 70%, sấy chân không ơ nhiệt độ 60°C thu được mẫu vật liệu dạng bột. Cân 0,002 g mẫu, trộn chung với 0,2 g KBr rồi ép thành viên có đường kính 13 mm và chiêu dày 0,5 mm. Các nhóm chức và liên kết hóa học của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được xác định bằng phổ hồng ngoại trên máy FT-IR Model 8400S, số sóng từ 7.800 – 350 cm-1 tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng.

2.2.5. Phương pháp đo phổ tử ngoại – khả kiến (UV-vis)

Khi áp dụng định luật Lambert - Beer cho trường hợp vật chất là dung dịch đựng trong cuvét có độ dày, l chứa chất hấp thụ có nồng độ C. Nhà bác học Beer đã đưa ra định luật Lambert – Beer: Với cùng bê dày của lớp dung dịch, hệ số hấp thụ k tỉ lệ với nồng độ của chất hấp thụ của dung dịch.

K = ε∗. C I = I . e−ε∗.C.l

Nếu đổi logarit tự nhiên vê logarit thập phân thì biểu thức của định luật Lambert - Beer có thể biểu diễn bằng biểu thức:

I = I . 10−ε∗.l.C Trong đó:

C: Nồng độ dung dịch, đo bằng mol/l

l: Bê dày của cuvét đựng dung dịch, đo bằng cm

ε: Hệ số tắt phân tử hay hệ số hấp thụ phân tử. ε là đại lượng xác định, phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ, bước sóng λ của bức xạ điện từ và nhiệt độ.

0

Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào việc đo cường độ ánh sáng còn lại sau khi đi qua dung dịch bị chất phân tích hấp thụ một phần. Nếu dung dịch phân tích trong suốt thì gọi là phương pháp đo màu. Phương pháp đo phổ tử ngoại – khả kiến UV-vis có thể dùng để định tính, định lượng các chất có màu và dung dịch keo.

Tiến hành: Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được để ổn định trong điêu

kiện bình thường, pha loãng đến 0,1 mM (tính theo nồng độ ban đầu), dung mơi là nước, sau cho vào cuvet thạch anh có chiêu dài đường truyên quang 1 cm, phổ UV-vis được đo trong dải bước sóng (wavelength) từ 800 – 200 nm, trên máy Jasco-V630 – Nhật Bản.

Dựa trên kết quả cường độ hấp thụ (E) và bước sóng hấp thụ UV-vis cực đại (max) của dung dịch keo để suy đoán sự thay đổi tính chất và liên kết của vật liệu.

2.2.6. Phương pháp khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS)

Phương pháp ICP-MS là một kỹ thuật phân tích dùng để xác định nồng độ đa nguyên tố và đồng vị trong các mẫu chất lỏng, rắn hoặc khí. Nó kết hợp nguồn plasma argon tạo ion với giới hạn phát hiện nhạy cảm của phát hiện khối phổ.

Với kích thước mẫu nhỏ, phải đảm bảo rằng các mẫu được thu thập là đại diện cho vật liệu khối. Do ICP-MS có thể phát hiện các yếu tố ơ nồng độ dưới dạng vài nanogram mỗi lít (phần nghìn tỷ), cần phải cẩn thận trong việc thu thập và lưu trữ mẫu trước khi đo. Nên hạn chế sử dụng các dụng cụ thủy do các tạp chất bị rò rỉ từ thủy tinh hoặc sự hấp thụ chất phân tích bằng thủy tinh. Nếu sử dụng thủy tinh, cần được rửa định kỳ bằng chất oxy hóa mạnh như axit cromic (H2Cr2O7) hoặc chất tẩy thủy tinh thương mại. Vật chứa mẫu sử dụng nhựa PTFE hoặc Teflon. Tất cả các vật chứa, pipet, đầu pipet nên được ngâm trong HNO3 từ 1 – 2%.

Mẫu ơ dạng rắn phải được nghiên thành bột mịn với cối và chày sứ sau đó rây qua lưới. Mẫu đầu tiên nên được loại bỏ để tránh nhiễm bẩn từ vữa hoặc rây. Phá mẫu bột sau rây bằng axit đậm đặc siêu tinh khiết hoặc các tác nhân oxy hóa như axit chloric (HClO3) và pha loãng theo đúng thứ tự cường độ với HNO3 từ 1 – 2%.

Mẫu ơ dạng khí cũng có thể được phân tích bằng cách tiêm trực tiếp vào dụng cụ. Ngồi ra, thiết bị sắc ký khí có thể được ghép nối với máy ICP- MS để tách nhiêu khí trước khi đưa vào mẫu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Mẫu ơ dạng lỏng hoặc dung dịch, các mẫu phải được pha loãng với HClO3 siêu tinh khiết 1 – 2% đến nồng độ thấp để tạo ra cường độ tín hiệu thấp hơn. Sau khi pha loãng, mẫu phải được lọc qua màng 0,25 – 0,45 μm để loại bỏ các hạt.

Mẫu phân tích được đưa vào đuốc plasma ICP dưới dạng sol khí bằng cách hút mẫu vào ống phun. Mẫu sẽ bị đê solvat và các nguyên tố trong sol khí sẽ được chuyển thành các ngun tử khí rồi được ion hóa tại phần cuối của đuốc plasma. Nguồn ICP chuyển các nguyên tử của nguyên tố trong mẫu thành các ion. Sau đó, những ion này được phân tách và phát hiện bằng thiết bị khối phổ.

Tiến hành: Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được đo và phân tích hàm

lượng Cu trên máy Perkin Elmer NexION 2000 – Mỹ tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng.

2.2.7. Đánh giá độ độc của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate

Chuột nhắt trắng giống Swiss được cung cấp bơi Viện Pasteur TP.HCM có trọng lượng từ 18 – 22 g. Chuột được nuôi ơ điêu kiện 25°C, ẩm độ phịng ni 65 – 72% với nguồn thức ăn tiêu chuẩn được cung cấp từ Viện Pasteur TP.HCM có bổ sung giá sống. Nước uống sạch được cung cấp đầy đủ qua bình nước chuyên dụng cho chuột. Thí nghiệm thử nghiệm độc tính cấp trên chuột trắng thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường (Đại học Nông Lâm TP.HCM).

2.2.7.1. Xác định độc tính qua đường miệng trên chuột

Độc tính cấp đường miệng được xác định theo phương pháp hướng dẫn OECD cho các thử nghiệm vê Hóa chất 423 – Độc tính cấp đường miệng 17/12/2001 [68].

Sau khi đưa vê phịng thí nghiệm, chuột được ni ổn định trong 3 ngày, ngừng cung cấp thức ăn cho chuột một đêm trước khi tiến hành thử nghiệm. Cân và ghi nhận trọng lượng từng con, tiến hành ghi số thứ tự trên lưng chuột và cho vào hộp nuôi lớn (hình 2.2). Chuột được chăm sóc ơ điêu kiện nhiệt độ

25°C ± 3°C, độ ẩm tương đối 40% – 70%. Thử nghiệm được thực hiện trên 2 nhóm chuột gồm:

+ Nhóm chứng âm: 06 con chuột khỏe mạnh (3 con chuột đực và 3 con chuột cái)

+ Nhóm thử nghiệm: 06 con chuột khỏe mạnh (3 con chuột đực và 3 con chuột cái)

Liêu thử nghiệm là 300 mg/kg và 3.000 mg/kg khối lượng cơ thể chuột. Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được pha loãng bằng nước cất để đạt nồng độ là 10 mg/mL và 100 mg/mL. Thể tích cho uống là 0,3 mL/10 g trọng lượng cơ thể chuột với nồng độ 10 mg/mL ơ liêu thử nghiệm 300 mg/kg và 0,3 mL/10g trọng lượng cơ thể chuột với nồng độ 100 mg/mL ơ liêu thử nghiệm

3.000 mg/kg.

Cho chuột uống chất thử bằng kim cong chuyên dụng (1 mL), theo dõi tỷ lệ chết ơ chuột trong vịng 15 ngày sau khi uống chất thử. Tính liêu LD50 theo phương pháp Behrens – Karber [69].

Hình 2.2. Chuột được ni trong hộp nhựa có gắn nắp lưới

2.2.7.2. Xác định kích ứng da (nhạy cảm da) trên chuột

Xác định kích ứng da trên chuột theo hướng dẫn OECD cho các thử nghiệm vê Hóa chất 406 – Nhạy cảm da 17/7/1992 [70].

Sau khi được đưa vê phịng thí nghiệm, chuột được ni ổn định trong 3 ngày, khoảng 24 giờ trước khi tiến hành thử nghiệm, cạo sạch lông ơ vùng lưng của chuột, diện tích vùng cạo là 1 cm2 (hình 2.3). Chuột được chăm sóc ơ điêu

kiện nhiệt độ 25°C ± 3°C, độ ẩm tương đối 40% – 70%. Thử nghiệm được thực hiện trên 03 nhóm chuột gồm:

+ Nhóm chứng âm: gồm 06 con chuột khỏe mạnh (03 con chuột đực và 03 con chuột cái). Chất tiếp xúc gây nhạy cảm là nước cất, chất thử thách là nước cất.

+ Nhóm thử nghiệm: gồm 20 con chuột khỏe mạnh (10 con chuột đực và con chuột 10 cái). Chất tiếp xúc gây nhạy cảm là vật liệu nano Cu2O- Cu/alginate (dùng nguyên mẫu), chất thử thách là vật liệu nano Cu2O- Cu/alginate (dùng nguyên mẫu).

+ Nhóm chứng dương: gồm 06 con chuột khỏe mạnh (03 con chuột đực và 03 con chuột cái). Chất tiếp xúc gây nhạy cảm là 2,4-dinitrochlorobenzene với nồng độ 8 mg/mL, chất thử thách là 2,4-dinitrochlorobenzene với nồng độ là 4 mg/mL.

Bôi 2 g chất thử/kg trọng lượng cơ thể chuột lên vùng da đã cạo lông. Các thời điểm tiếp xúc gây nhạy cảm là ngày 0, ngày 7 và ngày 14. Thời điểm thử thách là ngày 28.

Theo dõi các biểu hiện phản ứng nhạy cảm da (ban đỏ, phù nên hoặc các thay đổi khác trên da) của chuột trong 24 giờ và 48 giờ sau khi thử thách và đánh giá tỷ lệ nhạy cảm.