(neopullulanase) và loại II (isopullulanase) chỉ có thể cắt các liên kết α-1,4
glycosidic trong pullulan, giải phóng panose và isopanose Khác với các enzyme đã nêu, pullulan hydrolase loại III có khả năng tấn công pullulan tạo hỗn hợp sản phẩm maltotriose, panose, maltose và glucose Nó cũng tác dụng trên tinh bột, amylose và amylopectin tạo thành maltotriose và maltose là các sản phẩm chính
Sự khác biệt chính giữa pullulanase và isoamylase là pullulanase có thể thủy phân liên kết α-1,6 glycosidic của pullulan và amylopectin, trong khi isoamylase chỉ có thể thủy phân liên kết này trong amylopectin và glycogen [170] Thêm vào đó, pullulanase có độ bền nhiệt và phạm vi pH tương thích với β-amylase hơn nên mang lại hiệu quả cao hơn khi kết hợp với các enzym đường hóa [171]
Bảng 1 3 Sản phẩm tạo thành của các các nhóm enzyme pullulanase
1 4 4 Enzyme transglucosidase
Transglucosidase hay α-glucosidase (EC 3 2 1 20, α- D- glucoside
Enzyme Ký hiệu Tác dụng lên liên kết Cơ chất Sản phẩm cuối Tài liệu tham khảo Pullulanase loại I 3 2 1 41 α-1,6 glycosidic Oligosaccharide, Polysaccharide và Pullulan Maltotriose [172] , [173] Pullulanase loại II (amylopullulanase) 3 2 1 41 α-1,6 glycosidic α-1,4 glycosidic Pullulan Oligosaccharide và Polysaccharide (Tinh bột) Maltotriose Hỗn hợp glucose, maltose, maltotriose [174] – [176] Pullulanase hydrolase loại I (neopullulanse) 3 2 1 135 α-1,4 glycosidic Pullulan Panose [184] Pullulanase hydrolase loại II (isopullulanse) 3 2 1 57 α-1,4 glycosidic Pullulan Isopanose [179] Pullulanase hydrolase loại III
3 2 1 --- -- α-1,6 glycosidic α-1,4 glycosidic Pullulan Tinh bột, amylose, amylopectin Hỗn hợp panose, maltose và maltotriose Maltose và maltotriose [180]
oligosaccharide liên kết α và α-glucans Enzyme α-glucosidase được chứng minh thể hiện hoạt tính chuyển hóa glycosyl rõ ràng [181], [182]
Transglucosidase ưu tiên xúc tác sự hình thành các liên kết α- 1,6 glycosidic ngoài quá trình thủy phân, dẫn đến việc tạo thành các liên kết α-1,6 glycosidic Cấu trúc isomaltooligosaccharide tạo thành được đặc trưng đồng thời bởi giá trị DP của chúng (từ 2 đến ∼10), các kiểu liên kết (α- 1,2; α- 1,3; α- 1,4 và α- 1,6 glycosidic), tỷ lệ và vị trí của từng loại liên kết (chỉ α- 1,6; α-1,4 glycosidic hoặc các liên kết khác kết hợp) Trong đó, tỷ lệ giữa các loại liên kết phụ thuộc vào cơ chất và nguồn gốc của enzyme transglucosidase quyết định việc hình thành các liên kết cụ thể của nó [182], [183] Các enzyme α-glucosidase khác nhau từ động vật có vú, côn trùng, thực vật, nấm và vi khuẩn đã được thu nhận và nghiên cứu như Aspergillus niger
[184], Aspergillus oryzae [148], Aspergillus nidulans [182] và Saccharomyces logos [185] Chúng có khả năng phản ứng trên nền cơ chất đa dạng [186] Transglucosidase từ Aspergillus niger chỉ hoạt động tối ưu trên các oligomer của glucose có mức độ trùng hợp thấp (DP) [153]
Theo nghiên cứu của Pazur và French (1952) [148], khi sử dụng cơ chất maltose cho hoạt động của enzyme transglucosidase, các oligosaccharide đều chứa liên kết α-1,6 glycosidic Kết quả cho thấy enzyme này có khả năng chuyển các đơn vị glucose được liên kết bởi α-1,4 glycosidic thành liên kết α-1,6 glycosidic trên cơ chất thích hợp Cơ chế phản ứng được tác giả mô tả theo hai bước chính (Hình 1 14) Trong bước đầu tiên, enzyme lấy một đơn vị glucosyl khỏi maltose và tạo thành một phức trung gian enzyme-glucosyl Trạng thái năng lượng của phức glucosyl-enzyme là sự thay đổi năng lượng tự do cho phản ứng theo hướng tổng hợp liên kết 1,6- glycosidic là âm, trong khi đó năng lượng tự do thay đổi cho phản ứng theo hướng tổng hợp liên kết 1,4-glycosidic là dương Bằng chứng cho giải thích này được lấy từ các thí nghiệm với glucose phóng xạ và maltose C14-glucose trong hỗn hợp phản ứng được kết hợp thành isomaltose và dextrantriose nhưng không có trong maltose và panose Trong bước 2 của phản ứng, phần glucosyl của phức chất trung gian được chuyển sang một saccharide nền Trong một phản ứng glucose, maltose, maltotriose, isomaltose và panose có chức năng như các cơ chất Các phản ứng hoàn chỉnh trên maltose được thể hiện trong các phương trình đi kèm Các đường nằm ngang biểu thị các liên kết 1,4-glycosidic, các đường thẳng đứng biểu thị 1,6-glycosidic và G- là đơn vị glucose Enzyme dextran-dextrinase như transglucosidase sẽ chuyển đổi các polymer α-1,4-glucose (dextrin) thành các polymer α-1,6-glucose (dextran)
Hình 1 14 Cơ chế gắn nhánh của enzyme transglucosidase [148]
1 4 5 Enzyme glucanotransferase
Enzyme glucanotransferase được phân loại thuộc họ glycoside hydrolase (GH) và thuộc nhóm EC 2 4 Nó xúc tác phản ứng chuyển chuỗi α-1,4 glucan đến vị trí mới trong phân tử glucan nhận Enzyme ứng dụng điển hình trong tổng hợp tinh bột tiêu hóa chậm có thể kể tới enzyme gắn nhánh BE (branching enzyme) và
amylomaltase
Enzyme BE (hay 1,4-α-D-glucan: 1,4-α-D-glucan, 6-α-D-(1,4-α-D-glucano) α- transferase, EC 2 4 1 18, glucosyl hydrolase họ 13 hoặc 70, GH13, GH70) hoạt động trên liên kết α- 1,4 glycosidic và tạo nhánh liên phân tử hoặc nội phân tử α- glucan thông qua liên kết α- 1,6 glycosidic [187] Nguồn gốc thu nhận BE đa dạng từ vi sinh vật, thực vật và động vật BE từ nguồn vi khuẩn khác nhau có sự khác biệt nhỏ trong cơ chế của chúng [188], [189] BE từ Rhodothermus obamensis có khả năng chuyển liên kết α- 1,4 glycosidic của một đoạn chuỗi để tạo các liên kết α- 1,4 glycosidic mới tương tự với amylose, hình thành chuỗi tuyến tính kéo dài [190] Ngoài ra, đã có báo cáo BE từ Streptococcus mutans chủ yếu chuyển vị các chuỗi α- glucan ngắn với DP từ 6 đến 7 trong suốt quá trình gắn nhánh [191] Với cùng enzyme BE tiến hành trên bột gạo, các chuỗi nhánh dài hơn DP30 hoàn toàn biến mất và các chuỗi bên mới được tổng hợp vẫn còn sau khi xử lý β- amylase cho thấy vị trí rất gần nhánh của các chuỗi mạch đã được hình thành Ngoài ra, BE được chứng minh nó cũng xúc tác phản ứng tạo mạch vòng của amylose và amylopectin, sản phẩm tạo thành tương ứng là cycloamylose và cycloamylopectin [192] Sự hình thành các phân tử có độ phân nhánh cao nhờ enzyme BE đã tạo nên đặc tính tiêu hóa chậm cho tinh bột Kết quả này đã được chứng minh thông qua một số nghiên cứu về việc sản xuất α-glucan phân nhánh cao được sử dụng làm thành phần thực phẩm chức năng để tăng cường đặc tính tiêu hóa chậm [193], [194]
xúc tác chuyển một đoạn mạch α-1,4 glucan đến vị trí mới của liên kết α-1,4 glycosidic [195] Tương tự với BE, phản ứng bắt đầu bằng việc thủy phân liên kết α-1,4 glycosidic trong glucan cơ chất Sau khi loại đoạn mạch glucan khỏi cơ chất cho, amylomaltase tiếp tục gắn nó vào chuỗi chất nhận thông qua liên kết α-1,4 glycosidic mới [196] Sự biến đổi tinh bột bởi amylomaltase dẫn đến amylose bị thủy phân hoàn toàn và chuỗi mạch nhánh amylopectin được kéo dài Ngoài ra, amylomaltase cũng thể hiện hoạt động vòng hóa dẫn đến hình thành các
cycloamylose có từ 8 đến 32 đơn vị glucose [197] Xét về khả năng bị phân giải bởi enzyme, các chuỗi nhánh amylopectin kéo dài ít chịu tác động hơn Thật vậy, tinh bột ngô biến tính tại điều kiện tối ưu (70°C, pH 7,5) trong 4 giờ bằng amylomaltase nguồn gốc từ Acidothermus cellulolyticus 11B đã làm giảm hàm lượng tinh bột tiêu hóa nhanh từ 80% xuống 60% và tăng hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm từ 9% đến 20% [108]
Khi sử dụng trong sản xuất SDS, glucanotransferase thường được kết hợp với enzyme thủy phân bằng cách bổ sung riêng lẻ hoặc kết hợp sử dụng đồng thời [198]
1 5 Tính cấp thiết và nội dung nghiên cứu
Gần đây, trong một nghiên cứu về phong cách sống kinh tế xã hội dựa trên bảng câu hỏi về tần suất thực phẩm sử dụng của các đối tượng từ 35–70 tuổi ở 18 quốc gia đã chỉ ra việc tiêu thụ lượng lớn carbohydrate có sẵn trong thực phẩm có thể liên quan đến nguy cơ tử vong cao hơn [199] Ngày nay, nhận thức và hành vi người tiêu dùng khi sử dụng thực phẩm cũng đang dần thay đổi và chuyển hướng sang sử dụng nhiều hơn các thực phẩm dinh dưỡng có khả năng ngăn ngừa bệnh tật và cải thiện sức khỏe Điều này thể hiện qua doanh số bán thực phẩm có chức năng tăng cường sức khỏe tăng, đặc biệt là các sản phẩm chứa hàm lượng carbohydrate thấp, chất xơ cao, chất béo thấp, cholesterol thấp và natri thấp [9] Nghiên cứu thị trường dự báo nhu cầu này sẽ ngày càng tăng lên, cụ thể, thị trường prebiotics toàn cầu sẽ đạt 7,11 tỷ đô la vào năm 2024 (số liệu năm 2016) và nhu cầu về thực phẩm chức năng sinh học có hàm lượng đường huyết thấp bao gồm doanh thu thị trường tinh bột tiêu hóa chậm dự kiến đạt khoảng 12 tỷ đô la vào năm 2025 [8] Các nghiên cứu về quy trình sản xuất và công bố về lợi ích sức khỏe của các thành phần chức năng này cũng đang nhận được sự quan tâm mạnh mẽ bởi giới khoa học Theo dữ liệu tài nguyên phân tích bằng sáng chế toàn cầu của Patent Lens, trong giai đoạn 2013-2017, các bằng sáng chế liên quan đến IMO đã tăng 4,3% trong khi dữ liệu FOS (fructooligosaccharides) tăng 4,2% và GOS (galactooligosaccharide) tăng 2,1% Số liệu này cho thấy tầm quan trọng của các thành phần chức năng và thị trường ứng dụng của chúng đang ngày càng được mở rộng, đi đến gần hơn với người tiêu dùng
Có thể thấy, IMO và SDS là hai thành phần chức năng mang lại các lợi ích quý báu cho sức khỏe, phù hợp với định hướng phát triển của thị trường và đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng trong xã hội hiện đại Thêm vào đó, nguồn nguyên liệu chính được sử dụng để sản xuất IMO và SDS trong công nghiệp là tinh bột tự nhiên, đây cũng là một nguồn nguyên liệu dồi dào sẵn có và đang được chú trọng nghiên cứu để tăng cường giá trị thương mại tại Việt Nam Do đó, việc phát triển quy trình
sản xuất IMO và SDS từ tinh bột là đề tài mang tính cấp thiết hướng tới mục tiêu làm chủ quy trình sản xuất trong quy mô công nghiệp Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước hiện nay mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu và khảo sát trên nhiều đối tượng mà chưa đi đến việc phát triển các sản phẩm sau khi đã biến tính làm gia tăng SDS, RS Bên cạnh đó, các phương pháp biến tính của các nhóm tác giả chưa có hiệu quả cao trong việc nâng cao hàm lượng SDS Chính vì vậy, việc ứng dụng SDS trong sản xuất thực phẩm còn nhiều hạn chế và chưa đưa vào các sản phẩm một cách hiệu quả Thành phần IMO cũng chưa nhận được sự chú ý của các học giả, do đó, chưa có nghiên cứu nào về hoàn thiện quy trình sản xuất IMO từ tinh bột theo phương pháp enzyme tại Việt Nam
Khoai lang được biết đến là cây lương thực có sản lượng hàng năm lớn và tinh bột khoai lang là nguồn nguyên liệu dồi dào nhưng chưa có nhiều ứng dụng đem lại giá trị cao Các nghiên cứu tại Việt Nam hướng đến tạo thành phần chức năng trên tinh bột khoai lang cũng chưa được chú trọng Như vậy, đây là nguồn nguyên liệu mới và có tiềm năng lớn để khai thác sản xuất các thành phần thực phẩm chức năng
Từ những dữ kiện và phân tích trên, tác giả đi đến quyết định thực hiện đề tài
“Nghiên cứu quá trình thuỷ phân tinh bột khoai lang bằng phương pháp enzyme tạo tinh bột tiêu hoá chậm và isomaltooligosaccharide nhằm ứng dụng trong thực phẩm” với các nội dung:
Nội dung 1: Nghiên cứu đặc tính tinh bột khoai lang và khả năng thu hồi tinh bột của các giống khoai Việt Nam
Nội dung 2: Nghiên cứu điều kiện thu nhận tinh bột tiêu hóa chậm và đặc tính của tinh bột tiêu hóa chậm thành phẩm
2 1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thủy phân thích hợp tinh bột khoai lang bằng enzyme pullulanase hướng tới sự hình thành SDS
2 2 Nghiên cứu chế độ thoái hóa tinh bột sau thủy phân pullulanase làm tăng hàm lượng SDS
2 3 Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trình sản xuất tinh bột tiêu hóa chậm từ tinh bột khoai lang
Nội dung 3: Nghiên cứu điều kiện thu nhận isomaltooligosccharide và đặc tính của isomaltooligosccharide thành phẩm
3 1 Xác định điều kiện thu nhận isomaltooligosaccharide bằng phương pháp phân đoạn
3 2 Xác định điều kiện thu nhận isomaltooligosaccharide bằng phương pháp đường hóa và gắn nhánh đồng thời
Nội dung 4: Khảo sát khả năng ứng dụng tinh bột tiêu hóa chậm và isomaltooligosccharide trong sản xuất thực phẩm
4 1 Ứng dụng bổ sung tinh bột tiêu hóa chậm vào sản phẩm miến dong 4 2 Ứng dụng bổ sung IMO vào sản phẩm sữa tươi và nước quả
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Vật liệu nghiên cứu