Năm 2016, trong lá loài Ilex triflora Bl. xác định được sự có mặt của các nhóm hợp chất như: saponin, flavonoid, alkaloid, antharanoid, phytosterol, chất béo và tanin. Đồng thời, nhóm nghiên cứu đã phân lập và định danh được được 5 hợp chất triterpen là lupeol, uvaol, 3β-palmitoyloxy-urs-12-en-11-one, acid ursolic và 3-O-α- L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-α-kudinlactone [3].
Lupeol (Lup-20(29)-ene-3-ol Uvaol (Urs-12-ene-3,28,diol)
acid ursolic
13
3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-α-kudinlactone
1.3. Các phƣơng pháp chiết xuất và cô lập hợp chất thiên nhiên 1.3.1. Phƣơng pháp chiết
Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết. Có nhiều cách để tách chiết hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ [8].
1.3.1.1. Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng
Kĩ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction). Nguyên tắc căn bản của phương pháp này là sự phân bố (partition) của một chất tan (solute) vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Dựa vào hằng số phân bố K của một chất tan, cho biết được khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng
K= Ca
trong đó: Ca, Cb là nồng độ chất tan trong pha (a), pha (b) tại thời điểm Cb
cân bằng.
Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng thường được dùng để:
- Phân chia cao thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những đoạn có tính phân cực khác nhau.
Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực. Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết thực hiện nhiều lần, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần chiết được gộp lại, làm khan với các chất như Na2SO4, MgSO4, CaSO4… đuổi dung môi, thu được cao chiết [8].
1.3.1.2. Kĩ thuật chiết rắn – lỏng
Kĩ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation) được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp. Quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được thay thế liên tục bằng dung môi tinh khiết.
Kĩ thuật chiết ngâm dầm (Maceration), kĩ thuật này tương tự kĩ thuật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, dễ dàng thao tác với lượng lớn mẫu. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 24 giờ. Sau đó dịch chiết được lọc qua giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Chiết nhiều lần đến khi chiết kiệt.
Kĩ thuật chiết bằng máy Soxhlet là phương pháp chiết các chất ra khỏi nguyên liệu ban đầu bằng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dụng đặc biệt gọi là bình Soxhlet.
Kỹ thuật chiết hồi lưu: Chiết hồi lưu là phương pháp chiết các chất trong nguyên liệu ban đầu ở nhiệt độ sôi của dung môi. Kỹ thuật này giúp làm giảm thời gian chiết so với chiết ngâm dầm nhưng đồng thời chiết theo nhiều tạp chất hơn [8].
1.3.2. Các phƣơng pháp sắc kí
Trong các phương pháp phân tách hiện nay, sắc kí là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất dù có màu hay không màu, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn ra khỏi hỗn hợp, ngay cả những hỗn hợp phức tạp về thành phần và khác nhau về hàm lượng như dịch chiết các hợp chất từ cây cỏ.
Về nguyên tắc, sắc kí là phương pháp vật lí để tách hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại
15
hợp chất đó với một hệ thống gồm hai pha là pha động (pha chuyển động) và pha tĩnh (pha không chuyển động).
Việc tách hợp chất nào đó ra riêng có đạt được kết quả tốt hay không tùy thuộc vào hệ số phân bố K. Hệ số phân bố K được tính như sau:
K = Cs= Nồng độ của hợp chất trong pha tĩnhCM Nồng độ của hợp chất
trong pha động
Phân loại và gọi tên các phương pháp sắc kí dựa theo các tiêu chí khác nhau:
- Theo bản chất của hai pha sử dụng.
- Theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình tách chất.
- Theo hình dạng của pha tĩnh [8].
1.3.2.1. Phân loại theo bản chất của hai pha sử dụng
Cách phân loại này được trình bày trong bảng 1.3.
Bảng 1.3. Phân loại sắc ký theo bản chất pha động và pha tĩnh.
Pha động
Chất lỏng Chất khí Chất lỏng
Chất khí
Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Chất rắn thường dùng là alumin hoặc silicagel đã được xử lí, có thể được nạp vào cột nén hoặc được tráng thành một lớp mỏng phủ trên bề mặt tấm kính, tấm nhôm hoặc nhựa.Chất lỏng có thể được tẩm lên bề mặt một chất mang rắn hoặc một chuỗi dây cacbon dài được gắn lên trên chất mang rắn.
Pha động có thể là chất lỏng (gọi là dung môi giải li) hoặc chất khí (gọi là khí mang hay khí vectơ) [8].
1.3.2.2. Phân loại theo bản chất của hiện tƣợng xảy ra trong quá trình tách chất
Sắc kí phân bố (Partition Chromatography)
Nguyên tắc dựa vào việc mỗi hợp chất của hỗn hợp có hệ số phân bố khác nhau giữa pha tĩnh (chất lỏng tẩm trên bề mặt của pha tĩnh) với pha động (cũng là một chất lỏng).
Hệ số phân bố tùy thuộc vào khả năng hòa tan của hợp chất vào mỗi pha và vào tính chất phân cực của: mỗi hợp chất, pha động và pha tĩnh.
Sắc ký hấp thu (Adsorption Chromatography)
Nguyên tắc là các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của chất rắn pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh, hệ quả là trong quá trình pha động di chuyển, chúng sẽ tách nhau ra.
Có rất nhiều loại chất hấp thu dùng làm pha tĩnh, phổ biến nhất là silica gel và alumina… trong đó silica gel được sử dụng phổ biến hơn, còn alumina thường được dùng để tách các hợp chất có tính acid. Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm silanol –OH; đây là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạng với những hợp chất được sắc ký. Silica gel có thể được chế hóa bằng cách cho các nhóm chức silanol của silica tác dụng với nhiều loại clorur silil khác nhau để tạo thành những chất hấp thu mới với các đặc tính vật lí đổi khác, được gọi là silica gel tạo nối.
Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography)
Pha tĩnh là chất lỏng. Pha động là các hạt nhựa (gồm nhựa trao đổi cation và nhựa trao đổi anion).
Nguyên tắc: sự tách riêng các chất của một hỗn hợp dựa vào việc hợp chất nào của hỗn hợp có mang điện tích ngược dấu với điện tích của hạt nhựa, bị hạt nhựa giữ lại trong cột. Hợp chất mang nhiều điện tích gắn mạnh vào pha tĩnh, hợp chất nào mang ít điện tích gắn yếu và không mang điện không gắn và ra khỏi cột trước. Sắc ký lọc gel (Size Exclusion Chromatography/Gel Filtration
17
Nguyên tắc: sự tách riêng các chất của một hỗn hợp dựa vào những phân tử có kích thước nhỏ có thể chui vào những lỗ rỗng và bị lưu giữ lâu trong cột, còn những phân tử có kích thước lớn, không thể lọt vào lỗ rỗng, bị giải li ra khỏi cột.
Các loại gel có độ tạo mạng ngang lớn như Sephadex G-10 và G-15 rất thường dùng để tách những hợp chất thiên nhiên tan trong nước như cacbohidrat hoặc các peptit dây ngắn.
Trong hóa học các hợp chất thiên nhiên, các loại cao chiết từ cây cỏ thường có chứa nhiều tạp chất, thường gặp nhất là các diệp lục tố (chlorophyll a, b, ...). Các hợp chất này gây nhiều khó khăn cho quá trình cô lập tinh sạch các hợp chất hữu cơ. Các chlorophyll thường có trọng lượng phân tử tương đối lớn hơn nhiều so với phần lớn những hợp chất hữu cơ thông thường hay gặp trong cây cỏ nên muốn loại bỏ các hợp chất này, người ta thường sử dụng gel sephadex LH-20 [8].
1.3.2.3. Phân loại theo hình dạng của pha tĩnh
Sắc kí lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC) dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silica gel hay oxid alumin). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hay tấm plastic.
Sắc ký lớp mỏng là công cụ cần thiết cho việc phân lập hợp chất thiên nhiên bởi nó có nhiều công dụng. Chẳng hạn như: để biết đặc điểm của hợp chất vừa tách chiết cô lập; để so sánh hai hợp chất; để biết được số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp ban đầu; để kiểm tra độ tinh khiết… Bên cạnh đó, sắc ký lớp mỏng có nhiều ưu điểm như: sử dụng rất ít mẫu phân tích; quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết quả.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf, được tính:
a
Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử. b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi.
Sau khi giải li, các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (phát hiện bằng tia tử ngoại UV) hay dùng phương pháp hóa học (phun các thuốc thử để hiện hình).
Sắc kí cột
Sắc kí sử dụng một ống hình trụ, được đặt đứng, với đầu trên hở và đầu dưới gắn một khóa.
Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống trụ. Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt pha tĩnh. Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột, xuyên ngang qua pha tĩnh, rồi ra khỏi cột và được hứng trong những ống nghiệm [8].
1.4. Phƣơng pháp chiết xuất và phân lập saponin 1.4.1. Phƣơng pháp chiết xuất
Chiết xuất saponin toàn phần bằng dung môi methanol, ethanol, nước hoặc hỗn hợp ethanol : nước. Sử dụng ether dầu hỏa hoặc n-hexan để loại bỏ các hợp chất lipophilic. Dịch chiết xuất sau đó được hòa vào trong nước (có thể tan hoặc tạo nhũ tương) và lắc với n-butanol bão hòa với nước, thu lấy dịch chiết n-butanol [35].
1.4.2. Phƣơng pháp phân lập
- Dịch chiết đậm đặc được chiết thành các phân đoạn: n-hexan, chloroform, ethyl axetat. Trong đó phần nước chứa saponin triterpenoid chính.
- Phân đoạn nước, sử dụng cột Dianion HP-20 rửa bằng nước cất, sau đó là hỗn hợp MeOH – H2O 50%, MeOH 100% đến khi dịch rửa không màu.
- Các phân đoạn giống nhau được gộp chung lại và phân tách bằng sắc kí cột silicagel sử dụng hệ dung môi CHCl3 – MeOH – H2O (40 : 10 : 1).
- Kiểm tra saponin trên sắc kí bản mỏng, đốt với thuốc thử là H2SO4 10% hiện lên vết màu hồng [35].
19
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl. được thu hái ở Đà Lạt, Lâm Đồng vào tháng 10/2018.
Mẫu nghiên cứu do TS. Lương Văn Dũng, Khoa Sinh học, Trường Đại học Đà Lạt cung cấp và định danh tên khoa học.
2.2. Phƣơng pháp chiết xuất và phân lập 2.2.1. Phƣơng pháp chiết
Mẫu lá cây khô được xay thô sau đó tiến hành chiết ngâm dầm với cồn 70%. Sau đó, dịch chiết đậm đặc thu được chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: chloroform và ethyl acetate.
2.2.2. Phƣơng pháp sắc ký cột
Cột: Sử dụng các loại cột sắc ký có kích thước khác nhau tùy thuộc vào khối lượng mẫu chạy sắc ký.
Pha động: Tùy thuộc bản chất của mẫu đưa vào mà sử dụng các hệ dung môi giải hấp khác nhau như: chloroform – methanol, chloroform – methanol – nước, …
Pha tĩnh: Sắc ký cột được thực hiện với chất hấp phụ là silica gel (cỡ hạt 40-63 μm và 63-200 μm, Merck). Lượng chất dùng làm pha tĩnh với lượng mẫu theo tỉ lệ 30/1 g.
Ổn định cột: Pha tĩnh sau khi trộn đều với dung môi đầu tiên khai triển, được rót vào cột, mở khóa của cột cho dung môi chảy từ từ xuống, sau đó tiếp tục rót dung môi này vào cột để ổn định trong khoảng thời gian từ 1 – 2 giờ.
Đưa mẫu phân tích vào cột: dùng theo 2 cách:
Cách 1: Nếu mẫu hòa tan tốt trong dung môi đầu tiên khai triển, hòa tan mẫu với một ít dung môi rồi bơm đều vào cột đã được ổn định.
Cách 2: Với mẫu không thể hòa tan hết trong dung môi đầu tiên khai triển, hòa tan mẫu với methanol, sau đó thêm silica gel với tỉ lệ 2/1 g mẫu, lắc đều và cô loại methanol ở áp suất thấp đến khi khô. Sau đó, đưa bột silica gel đã tẩm mẫu vào cột đã ổn định.
Khai triển cột: hứng các phân đoạn sau đó dùng sắc ký bản mỏng kiểm tra để xác định thời điểm đổi hệ dung môi và gộp chung những phân đoạn có cấu tử giống nhau, cô loại dung môi để tiến hành các bước phân tích tiếp theo.
2.2.3. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254
(Merck) và silica gel RP (Merck). Thuốc thử hiện màu là dung dịch acid sulfuric 10% và đèn tử ngoại bước sóng 254 và 365 nm.
2.2.4. Phƣơng pháp tinh chế sản phẩm
- Tiến hành chạy cột sắc kí thu lấy phân đoạn sạch nhất.
- Tinh chế các chất phân lập được bằng phương pháp kết tinh lại. Các bước của quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung môi, hòa tan nóng và lọc, để kết tinh lạnh, lọc hút tinh thể và làm khô. Sản phẩm được kết tinh nhiều lần trong dung môi thích hợp.
2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý và các phương pháp phổ bao gồm: phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối lượng. Phổ IR được ghi trên máy Nicolet IS5 FT-IR. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY được ghi trên máy Brucker Avance-500 MHz, chuẩn nội TMS. Phổ khối ESI-MS được ghi trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap.
21
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Điều chế các dịch chiết từ lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl.
2 kg lá Ilex triflora Bl. khô đã được xay thô, chiết ngâm dầm 6 lần với ethanol 70%, mỗi lần ngâm từ 3 – 5 ngày. Thể tích ethanol 70% sử dụng cho các lần ngâm lần lượt là: 9,4 lít; 5,0 lít; 3,5 lít; 3,5 lít; 3,5 lít; 3,2 lít. Thu lấy dịch chiết, lọc qua giấy lọc. Các dịch chiết được gộp lại và cất loại ethanol đến còn 1,5 lít dung dịch đậm đặc. Kết tủa hợp chất hữu cơ ít phân cựcbằng cồn 30%, đun nóng (không đun sôi), để qua đêm. Lọc phần dịch lọc, cô cách thủy cho bay hơi dung môi đến còn khoảng 1/2 thể tích.Chuyển dung dịch đậm đặc này sang bình chiết quả lê và chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần: chloroform, ethyl acetat. Cất loại hết dung môi thu lấy phân đoạn chiết tương ứng: chloroform (7,16 g), ethyl acetat (3,69 g) và nước (74,77 g).
3.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl.3.2.1 Quy trình phân lập 3.2.1 Quy trình phân lập
Cắn chiết nƣớc (74,77 g) hòa tan trong nước tiến hành sắc kí cột Diaion HP-
20. Rửa cột với nước cất đến khi dịch rửa không màu. Sau đó rửa giải với hỗn hợp methanol – nước nồng độ 50% và với methanol 100% thu được 46 phân đoạn methanol – nước (MH1 – MH46), 20 phân đoạn methanol (M1 – M20), phân đoạn nước không sử dụng.
- Phân đoạn M4-5 (2,33 g) tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel (63-