- Chạy điện di ADN cắt giới hạn trên gel agarose 0,8%, điện thế 4050V, 1214 giờ.
3.3.4.Kết quả lai Southern
Các công bố về kết quả phân tích gen chuyển bằng lai Southern ở cây lúa, lúa mì, lúa mạch, yến mạch chỉ ra rằng số lợng điểm gắn của gen chuyển thay đổi phụ thuộc vào kỹ thuật đã áp dụng khi chuyển gen [15], [26]. Khi tạo cây chuyển gen bằng bắn gen, điểm gắn gen chuyển thờng là đa điểm, thay đổi từ 1 đến nhiều điểm,
có khi tới 10 điểm khác nhau [10], [11], [13], [17]. Trong khi đó, ở các cây chuyển gen thông qua Agrobacterium, gen chuyển đa phần gắn ở đơn điểm [21], [29], [30].
Trong thí nghiệm của chúng tôi, để tăng tính đặc hiệu quá trình lai giữa mẫu dò gen CryIA và genom bông chuyển gen, chúng tôi tiến hành lai ở nhiệt độ cao là 67 0C. Quá trình lai xảy ra trong 14-16 giờ. Trong thí nghiệm đầu đã không thu đợc ảnh lai của gen CryIA mà chỉ có thang ADN chuẩn. Điều này chứng tỏ quy trình lai đợc thực hiện đúng, chỉ có quá trình lai của gen CryIA là không xảy ra hoặc xảy ra quá yếu.
Khi tăng nồng độ mẫu dò lên tối đa là 50 ng/ml dung dịch lai trong thí nghiệm lần thứ 2, đã thu đợc các băng lai ở 4/12 dòng trên màng lai, trong đó một dòng mang gen chuyển ở hai điểm khác nhau, số còn lại có gen chuyển ở một điểm (hình 12). ở đây quá trình lai giữa mẫu dò và gen CryIA trong cây bông chuyển gen đã xảy ra, nhng không phải ở tất cả các mẫu ADN. Theo chúng tôi, có yếu tố đã cản trở quá trình lai trên genom cây bông.
Trên màng lai thứ 3, chúng tôi cũng chỉ nhận đợc băng lai ở 1/16 dòng. Điều này càng nhấn mạnh sự cản trở quá trình lai gen CryIA trong genom cây bông. ở cả 3 màng, ảnh lai các vạch của thang ADN chuẩn rất rõ.
Tài liệu tham khảo về các thí nghiệm phân tích lai Southern cây bông chuyển gen rất hạn chế. Chúng tôi cha tìm đợc một công bố đầy đủ và cụ thể nào liên quan đến kết quả lai Southern ở cây bông trên các mạng lu trữ tài liệu khoa học nh PubMed, PNAS online. Chúng tôi sẽ tiến hành lai Southern của gen CryIA(c) ở các cây lúa chuyển gen kháng sâu. Qua so sánh kết quả chúng tôi có thể khẳng định quy trình sử dụng hệ thống DIG đã đợc hoàn thiện hay cần sửa đổi chi tiết nào.
Hình 12: Kết quả lai Sothern của gen CryIA ở các dòng bông kháng sâu. 1: Thang ADN chuẩn; 2-13: Các dòng bông kháng sâu
Kết luận và kiến nghị
Kết luận:
1. Để phân tích phân tử các dòng bông kháng sâu, ADN tổng số đã đợc tách từ lá mầm hoặc lá non của cây bông. Hàm lợng ADN thu đợc 7-10 àg từ 200 mg lá. ADN đủ chất lợng để tiến hành phân tích phân tử.
2. Phản ứng PCR nhân gen CryIA đợc tiến hành với 30 dòng bông kháng sâu, trong đó 26 dòng có kết quả dơng tính.
3. Đã thực hiện thành công kỹ thuật lai Southern bao gồm các bớc nh sau: Chọn HindIII làm enzym cắt ADN genom bông; ADN phân giải đều trên bản gel điện di và đợc thấm chuyển hoàn toàn lên màng lai nylon; đánh dấu mẫu dò bằng hệ thống phi phóng xạ DIG và thu đợc kết quả ở 5 dòng, trong đó 1 dòng mang 2 điểm gắn gen, số còn lại mang 1 điểm gắn.
Kiến nghị:
Đây là kết quả bớc đầu hoàn thiện quy trình lai Southern bằng sử dụng hệ thống phi phóng xạ DIG. Đề nghị ứng dụng kỹ thuật này vào phân tích tiếp các loài chuyển gen khác (lúa kháng sâu, chịu bệnh bạc lá vi khuẩn, đu dủ kháng bệnh virus đốm vòng).