Sắc kí lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC) dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silica gel hay oxid alumin). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hay tấm plastic.
Sắc ký lớp mỏng là công cụ cần thiết cho việc phân lập hợp chất thiên nhiên bởi nó có nhiều công dụng. Chẳng hạn như: để biết đặc điểm của hợp chất vừa tách chiết cô lập; để so sánh hai hợp chất; để biết được số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp ban đầu; để kiểm tra độ tinh khiết… Bên cạnh đó, sắc ký lớp mỏng có nhiều ưu điểm như: sử dụng rất ít mẫu phân tích; quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết quả.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf, được tính:
Rf = a
Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử. b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi.
Sau khi giải li, các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (phát hiện bằng tia tử ngoại UV) hay dùng phương pháp hóa học (phun các thuốc thử để hiện hình).
Sắc kí cột
Sắc kí sử dụng một ống hình trụ, được đặt đứng, với đầu trên hở và đầu dưới gắn một khóa.
Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống trụ. Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt pha tĩnh. Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột, xuyên ngang qua pha tĩnh, rồi ra khỏi cột và được hứng trong những ống nghiệm [8].
1.4. Phƣơng pháp chiết xuất và phân lập saponin 1.4.1. Phƣơng pháp chiết xuất
Chiết xuất saponin toàn phần bằng dung môi methanol, ethanol, nước hoặc hỗn hợp ethanol : nước. Sử dụng ether dầu hỏa hoặc n-hexan để loại bỏ các hợp chất lipophilic. Dịch chiết xuất sau đó được hòa vào trong nước (có thể tan hoặc tạo nhũ tương) và lắc với n-butanol bão hòa với nước, thu lấy dịch chiết n-butanol [35].
1.4.2. Phƣơng pháp phân lập
- Dịch chiết đậm đặc được chiết thành các phân đoạn: n-hexan, chloroform, ethyl axetat. Trong đó phần nước chứa saponin triterpenoid chính.
- Phân đoạn nước, sử dụng cột Dianion HP-20 rửa bằng nước cất, sau đó là hỗn hợp MeOH – H2O 50%, MeOH 100% đến khi dịch rửa không màu.
- Các phân đoạn giống nhau được gộp chung lại và phân tách bằng sắc kí cột silicagel sử dụng hệ dung môi CHCl3 – MeOH –H2O (40 : 10 : 1).
- Kiểm tra saponin trên sắc kí bản mỏng, đốt với thuốc thử là H2SO4 10% hiện lên vết màu hồng [35].
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl. được thu hái ở Đà Lạt, Lâm Đồng vào tháng 10/2018.
Mẫu nghiên cứu do TS. Lương Văn Dũng, Khoa Sinh học, Trường Đại học Đà Lạt cung cấp và định danh tên khoa học.
2.2. Phƣơng pháp chiết xuất và phân lập 2.2.1. Phƣơng pháp chiết
Mẫu lá cây khô được xay thô sau đó tiến hành chiết ngâm dầm với cồn 70%. Sau đó, dịch chiết đậm đặc thu được chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: chloroform và ethyl acetate.
2.2.2. Phƣơng pháp sắc ký cột
Cột: Sử dụng các loại cột sắc ký có kích thước khác nhau tùy thuộc vào khối lượng mẫu chạy sắc ký.
Pha động: Tùy thuộc bản chất của mẫu đưa vào mà sử dụng các hệ dung môi
giải hấp khác nhau như: chloroform – methanol, chloroform – methanol – nước, …
Pha tĩnh: Sắc ký cột được thực hiện với chất hấp phụ là silica gel (cỡ hạt 40-63
μm và 63-200 μm, Merck). Lượng chất dùng làm pha tĩnh với lượng mẫu theo tỉ lệ 30/1 g.
Ổn định cột: Pha tĩnh sau khi trộn đều với dung môi đầu tiên khai triển, được
rót vào cột, mở khóa của cột cho dung môi chảy từ từ xuống, sau đó tiếp tục rót dung môi này vào cột để ổn định trong khoảng thời gian từ 1 – 2 giờ.
Đưa mẫu phân tích vào cột: dùng theo 2 cách:
Cách 1: Nếu mẫu hòa tan tốt trong dung môi đầu tiên khai triển, hòa tan mẫu với một ít dung môi rồi bơm đều vào cột đã được ổn định.
Cách 2: Với mẫu không thể hòa tan hết trong dung môi đầu tiên khai triển, hòa tan mẫu với methanol, sau đó thêm silica gel với tỉ lệ 2/1 g mẫu, lắc đều và cô loại methanol ở áp suất thấp đến khi khô. Sau đó, đưa bột silica gel đã tẩm mẫu vào cột đã ổn định.
Khai triển cột: hứng các phân đoạn sau đó dùng sắc ký bản mỏng kiểm tra để xác định thời điểm đổi hệ dung môi và gộp chung những phân đoạn có cấu tử giống nhau, cô loại dung môi để tiến hành các bước phân tích tiếp theo.
2.2.3. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck) và silica gel RP (Merck). Thuốc thử hiện màu là dung dịch acid sulfuric 10% và đèn tử ngoại bước sóng 254 và 365 nm.
2.2.4. Phƣơng pháp tinh chế sản phẩm
- Tiến hành chạy cột sắc kí thu lấy phân đoạn sạch nhất.
- Tinh chế các chất phân lập được bằng phương pháp kết tinh lại. Các bước của quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung môi, hòa tan nóng và lọc, để kết tinh lạnh, lọc hút tinh thể và làm khô. Sản phẩm được kết tinh nhiều lần trong dung môi thích hợp.
2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý và các phương pháp phổ bao gồm: phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối lượng. Phổ IR được ghi trên máy Nicolet IS5 FT-IR. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY được ghi trên máy Brucker Avance-500 MHz, chuẩn nội TMS. Phổ khối ESI-MS được ghi trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap.
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1. Điều chế các dịch chiết từ lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl.
2 kg lá Ilex triflora Bl. khô đã được xay thô, chiết ngâm dầm 6 lần với ethanol 70%, mỗi lần ngâm từ 3 – 5 ngày. Thể tích ethanol 70% sử dụng cho các lần ngâm lần lượt là: 9,4 lít; 5,0 lít; 3,5 lít; 3,5 lít; 3,5 lít; 3,2 lít. Thu lấy dịch chiết, lọc qua giấy lọc. Các dịch chiết được gộp lại và cất loại ethanol đến còn 1,5 lít dung dịch đậm đặc. Kết tủa hợp chất hữu cơ ít phân cựcbằng cồn 30%, đun nóng (không đun sôi), để qua đêm. Lọc phần dịch lọc, cô cách thủy cho bay hơi dung môi đến còn khoảng 1/2 thể tích.Chuyển dung dịch đậm đặc này sang bình chiết quả lê và chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần: chloroform, ethyl acetat. Cất loại hết dung môi thu lấy phân đoạn chiết tương ứng: chloroform (7,16 g), ethyl acetat (3,69 g) và nước (74,77 g).
3.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl. 3.2.1 Quy trình phân lập 3.2.1 Quy trình phân lập
Cắn chiết nƣớc (74,77 g) hòa tan trong nước tiến hành sắc kí cột Diaion HP- 20. Rửa cột với nước cất đến khi dịch rửa không màu. Sau đó rửa giải với hỗn hợp methanol – nước nồng độ 50% và với methanol 100% thu được 46 phân đoạn methanol – nước (MH1 – MH46), 20 phân đoạn methanol (M1 – M20), phân đoạn nước không sử dụng.
- Phân đoạn M4-5 (2,33 g) tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel (63- 200µm, Merck), hệ dung môi giải hấp chloroform – methanol (8,5 : 1,5) thu được 200 phân đoạn A1-200. Gộp phân đoạn A13-50 (300 mg) tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel (40-63µm, Merck), hệ dung môi giải hấp chloroform – methanol (9:1) cho 40 phân đoạn B1-40.
+ Phân đoạn B15-16 để kết tinh trong ống nghiệm thu được 5mg chất
ITS02.
- Phân đoạn M2-3 (10,6 g) tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel (40-63µm, Merck), hệ dung môi giải hấp chloroform – methanol theo tỉ lệ lần lượt là 6 : 1; 5 : 1; 4 : 1; 3 : 1; 2 : 1; 1 : 1 cho 60 phân đoạn C1-60.
+Phân đoạn C32-34 tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel (40-63µm, Merck), hệ dung môi giải hấp chloroform – methanol (4 : 1) thu được 48 phân đoạn D1-48. Gom phân đoạn D19-41 sau đó cho kết tinh trong hệ dung môimethanol – aceton – diethyl ether (1 : 8: 2) thu được hợp chất ITS03.
+ Phân đoạn C23-26 tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel (40-63µm, Merck), hệ dung môi giải hấp chloroform – methanol (7 : 1) thu được 45 phân đoạn E1-45. Gom phân đoạn E24-33 sau đó cho kết tinh trong hệ dung môi methanol – aceton – diethyl ether (1 : 8 : 2) thu được hợp chất ITS05.
3.2.2 Thông số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất phân lập đƣợc 3.2.2.1. ITS01
Hơ ̣p chất ITS01 thu được dưới da ̣ng chất kết tinh không màu. Phổ IR (KBr): max, cm-1: 3417 (OH); 2943(C-H); 1729 (COO). Phổ ESI-MS: m/z 800,3 [M+HCl]- , M = 764 (C41H64O13). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ, ppm: 5,46 (1H, brs, H-12); 5,13 (1H, s, H- 1”); 4,58 (1H, d, 4,5Hz, H-1’); 3,91 (1H, brs, H-2”); 3,86 (1H, m, H-5’a); 3,82 (1H, m, H-5”); 3,81 (1H, m, H-4’); 3,79 (1H, m, H-2’); 3,76 (1H, m, H-3’); 3,72 (1H, dd, 9,5; 3,0Hz, H-3”); 3,51 (1H, dd, 11,5; 2,5Hz, H-5’b); 3,41 (1H, m, H-4”); 3,17 (1H, dd, 11,5; 4,5,); 2,31 (1H, m, H-21a); 2,25 (1H, m, H-16a); 1,91 (2H, m, H-11, H-9); 1,90 (1H, m, H-2a); 1,83 (3H, m, H-2b, H-22); 1,78 (2H, m, H-1a, H-11); 1,70 (1H, m, H-21b); 1,61 (1H, m, H-15); 1,58 (1H, m, H-6a); 1,52 (2H, m, H-7); 1,39 (1H, m, H-6b); 1,37 (3H, s, H-30); 1,36 (1H, m, H-16b, 3H, s, H-29); 1,35 (3H, s, H-27); 1,25 (3H, ,d, 6,5Hz, H-6”); 1,22 (1H, m, H-15b); 1,12 (1H, m, H-1b); 1,05 (3H, s, H-23); 0,97 (3H, s, H-25); 0,88 (1H, m, H-5); 0,86 (3H, s, H-24); 0,85 (3H, s, H- 26). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD) δ, ppm: 39,87 (C-1); 28,66 (C-2); 90,54 (C- 3); 40,33 (C-4); 57,14 (C-5); 19,29 (C-6); 36,25 (C-7); 42,75 (C-8); 45,65 (C-9);
37,89 (C-10); 27,11 (C-11); 67,58 (C-12); 147,27 (C-13); 44,73 (C-14); 29,56 (C- 15); 26,64 (C-16); 45,15 (C-17); 138,54 (C-18); 75,05 (C-19); 86,99 (C-20); 28,66 (C-21); 33,22 (C-22); 28,62 (C-23); 17,05 (C-24); 16,96 (C-25); 18,46 (C-26); 23,55 (C-27); 177,67 (C-28); 25,15 (C-29); 19,37 (C-30); 104,78 (C-1’);76,87 (C- 2’); 73,05 (C-3’); 68,38 (C-4’); 63,71 (C-5’); 102,04 (C-1”); 72,19 (C-2”, C-3”); 73,91 (C-4”); 70,23 (C-5”); 17,98 (C-6”). 3.2.2.2. ITS02
Hơ ̣p chất ITS02 thu được dưới da ̣ng chất kết tinh không màu. Phổ IR (KBr):max, cm-1: 3413 (OH); 2914 (C-H); 1703 (COO). Phổ ESI-MS: m/z 450,5 [M-Rha-Ara-H2O]+, M = 746(C41H62O13). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ, ppm: 7,02 (1H, dd, 10,5; 3,0 Hz, H-11); 5,84 (1H, dd, 10,5; 1,5Hz, H-12); 5,13 (1H, s, H-1’’); 4,58 (1H, d, 4,5 Hz, H- 1’);3,91 (1H, brs, H-2”); 3,86 (1H, m, H-5’b); 3,82 (1H, m, H-5”); 3,81 (1H, m, H- 4’); 3,79 (1H, m, H-2’); 3,76 (1H, m, H-3’); 3,72 (1H, d, 7,5Hz, H-3”); 3,51 (1H, dd, 11,5; 2,5Hz, H-5’a); 3,41 (1H, m, H-4”); 3,17 (1H, dd, 11,5 ; 4,0 Hz , H-3);2,31 (1H, m, H-21a); 2,29 (1H, m, H-16a); 2,06 (1H, m, H-9); 1,94 (1H, m, H-1a, 1H, m, H-2a); 1,83 (2H, m, H-22); 1,81 (1H, m, H-2b); 1,68 (1H, m, H-21); 1,65 (1H, m, H-6a); 1,60 (1H, m, H-15a); 1,46 (1H, m, H-6b); 1,42 (2H, m, H-7); 1,40 (3H, s, H- 29, 1H, m, H-16b); 1,36 (3H, s, H-30); 1,24 ( 3H, d, 6,0Hz, H-6’’); 1,17 (1H, m, H- 15b); 1,10 (1H, m, H-1b); 1,04 (3H, s, H-23); 1,04 (3H, s, H-27); 0,97 (3H, s, H- 25); 0,90 (1H, m, H-5); 0,89 (3H, s, H-24); 0,76 (3H, s, H-26). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD) δ, ppm: 39,25 (C-1); 26,92 (C-2); 90,44 (C- 3); 40,39 (C-4); 56,37 (C-5); 19,21 (C-6); 33,75 (C-7); 43,15 (C-8); 55,59 (C-9); 37,58 (C-10); 127,71 (C-11); 129,51 (C-12); 142,64 (C-13); 43,19 (C-14); 26,49 (C-15); 26,81 (C-16); 44,60 (C-17); 134,22 (C-18); 75,07 (C-19); 84,14 (C-20); 29,00 (C-21); 33,39 (C-22); 28,28 (C-23); 16,51 (C-24); 18,73 (C-25); 16,97 (C- 26); 18,83 (C-27); 177,81 (C-28); 23,36 (C-29); 19,40 (C-30); 104,83 (C-1’); 76,89 (C-2’); 73,06 (C-3’); 68,40 (C-4’); 63,71 (C-5’); 102,08 (C-1”); 72,18 (C-2”, C-3”); 73,90 (C-4”); 70,23 (C-5”); 17,96 (C-6”).
3.2.2.3. ITS03
Hơ ̣p chất ITS03 thu được dưới da ̣ng chất kết tinh không màu. Phổ IR(KBr):max, cm-1: 3420 (OH); 2942 (C-H); 1728 (COO).
Phổ ESI-MS: m/z 949,2 [M+Na]+ , m/z 803,4 [M-Rha+Na]+ , m/z 747,5 [M-Glc-
H2O+H]+, m/z 485,1 [M-Glc-Rha-Ara-H]+, M = 926 (C47H74O18). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ, ppm: 5,46 (1H, brs, H-12); 5,24 (1H, s, H- 1”); 4,54 (1H, d,6,5Hz, H-1’); 4,52 (1H, d, 8,0Hz, H-1’’’); 4,06 (1H, m, H-4’); 3,91 (1H, m, H-5’a); 3,95 (1H, brs, H-2”); 3,90 (1H, m, H-2’, 1H, m, H-3’); 3,88 (1H, m, H-5”); 3,86 (3H, m, H-5’’’); 3,71 (1H, dd, 12,0; 5,0Hz, H-6’’’); 3,74 (1H, dd, 9,5; 3,0Hz, H-3”); 3,54 (1H, dd, 12,0; 2,5Hz, H-5’b); 3,42 (1H, m, H-4”, 1H, m, H-3’’’); 3,37 (1H, m, H-4’’’); 3,34 (1H, m, H-5’’’); 3,32 (1H, m, H- 2’’’); 3,21 (1H, dd,11,5; 4,5Hz, H-3); 2,31 (1H, m, H-21a); 2,25 (1H, m, H-16a); 1,90 (2H, m, H- 2a, H-9); 1,86 (1H, m, H-11); 1,83 (3H, m, H-2a, H-22a, b); 1,77 (1H, m, H-1a); 1,76 (1H, m, H-11b); 1,70 (1H, m, H-21b) 1,61 (1H, m, H-15a); 1,58 (1H,m, H-6a); 1,52 (2H, m, H-7); 1,39 (1H, m, H-6b); 1,37 (3H, s, H-30); 1,36 (1H, m, H-16b, 3H, s, H-29); 1,35 (3H, s, H-27); 1,25 (3H, d, 6,5Hz, H-6”); 1,22 (1H, m, H-15b); 1,13 (1H, m, H-1a); 1,05 (3H, s, H-23); 0,96 (3H, s, H-25); 0,87 (3H, s, H-24); 0,85 (3H, s, H-26); 0,85 (1H, m, H-5). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD) δ, ppm: 40,02 (C-1); 28,63 (C-2); 89,67 (C- 3); 40,40 (C-4); 57,26 (C-5); 19,20 (C-6); 36,23 (C-7); 42,74 (C-8); 45,65 (C-9); 37,87 (C-10); 27,23 (C-11); 67,59 (C-12); 147,23 (C-13); 44,72 (C-14); 29,54 (C- 15); 26,59 (C-16); 45,15 (C-17); 138,40 (C-18); 75,06 (C-19); 87,07 (C-20); 28,63 (C-21); 33,16 (C-22); 28,63 (C-23); 17,24 (C-24); 17,01 (C-25); 18,43 (C-26); 23,56 (C-27); 177,84 (C-28); 25,13 (C-29); 19,37 (C-30); 105,07 (C-1’); 75,22 (C- 2’); 82,01 (C-3’); 68,46 (C-4’); 64,61 (C-5’); 101,90 (C-1”); 72,06 (C-2”, C-3”); 73,78 (C-4”); 70,26 (C-5”); 17,98 (C-6”); 104,24 (C-1’’’); 74,99 (C-2’’’); 77,95 (C- 3’’’, C-5’’’); 71,15 (C-4’’’); 62,34 (C-6’’’).
3.2.2.4. ITS05
Hơ ̣p chất ITS05 thu được dưới da ̣ng chất kết tinh không màu. Phổ IR(KBr):max, cm-1: 3423 (OH); 2936 (C-H); 1734 (COO).
Phổ ESI-MS: m/z 935,5 [M + Na]+ , M=912 (C47H76O17) Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ, ppm: 5,34 (1H, d, 8,0Hz, H-1’’’); 5,31 (1H, brs, H-12); 5,11 (1H, s, H-1”); 4,58 (1H, d, 4,5Hz, H-1’); 3,91 (1H, m, H-5’a); 3,90 (1H, brs, H-2”); 3,82 (1H, m, H-6’’’a); 3,81 (1H, m, H-5”); 3,80 (1H, m, H- 2’); 3,79 (1H, m, H-2’); 3,76 (1H, m, H-2’’’); 3,71 (1H, m, H-3’); 3,70 (1H, m, H- 3”, 1H, m, H-6’’’b); 3,50 (1H, dd 11,5; 3,0Hz, H-5’b); 3,42 (1H, m, H-4’’’); 3,38 (1H, m, H-4”); 3,36 (1H, m, H-4’’’); 3,34 (1H, m, H-5’’’); 3,14 (1H, dd, 11,5; 4,5Hz, H-3); 2,62 (1H, m, H-16a); 2,53 (1H, s, H-18); 1,97 (1H, m, H-11a); 1,85 (1H, m, H-15a); 1,83 (1H, m, H-2a); 1,79 (1H, m, H-22a); 1,75(1H, m, H-2b, 1H, m, H-21a); 1,68 (1H, m, H-9); 1,66 (1H, m, H-1a); 1,65 (2H, m, H-22b, H-16); 1,55 (1H, m, H-6a); 1,54 (1H, m, H-7a); 1,43 (1H, m, H-6b); 1,39 (1H, m, H-20); 1,35(3H, s, H-27); 1,32 (1H, m, H-7b); 1,30 (1H, m, H-11b); 1,27 (1H, m, H-21b); 1,25 (3H, d, 6,0Hz, H-6”); 1,22 (3H, s, H-29); 1,04 (3H, s, H-23); 1,03 (1H, m, H- 1b); 1,02 (1H, m, H-15b); 0,98 (3H, s, H-25); 0,96 (3H, d, 5,0Hz, H30); 0,87 (3H, s, H-24); 0,80 (3H, s, H-26); 0,77 (1H, m, H-5). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD) δ, ppm: 39,98 (C-1); 27,03 (C-2); 90,75 (C- 3); 38,08 (C-4); 57,05 (C-5); 19,51 (C-6); 34,16 (C-7); 40,26 (C-8); 48,66 (C-9); 37,89 (C-10); 24,72 (C-11); 129,73 (C-12); 139,58 (C-13); 41,30 (C-14); 29,68 (C- 15); 26,56 (C-16); 47,19 (C-17); 54,98 (C-18); 72,95 (C-19); 42,94 (C-20); 27,22 (C-21); 38,30 (C-22); 28,68 (C-23); 17,07 (C-24); 16,03 (C-25); 17,64 (C-26); 24,66 (C-27); 178,55 (C-28); 27,10 (C-29); 16,58 (C-30); 104,69 (C-1’); 76,86 (C- 2’); 73,91 (C-3’); 68,27 (C-4’); 63,57 (C-5’); 102,04 (C-1”); 72,19 (C-2”, C-3”); 73,91 (C-4”); 70,23 (C-5”); 17,98 (C-6”); 95,80 (C-1’’’); 72,95 (C-2’’’); 78,33 (C- 3’’’); 71,19 (C-4’’’); 78,56 (C-5’’’); 62,49 (C-6’’’).
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Quy trình phân lập
Hình 4.1. Sơ đồ quy trình phân lập các saponin từ lá cây Ilex triflora Bl..
CC silica gel, CHCl3/MeOH B20 B15-16 ITS01 (10 mg) ITS02 (5 mg) Kết tinh Kết tinh CC silica gel, CHCl3/MeOH CC silica gel, CHCl3/MeOH E24-33
Chiết ngâm dầm với cồn 70%
Nguyên liệu khô (2 kg)
Dịch chiết đậm đặc Cồn 30% Dịch lọc Kết tủa Cắn EtOAc (3,69 g) Cắn CHCl3 (7,16 g) Cắn nước (74,77 g) CC diaion MH1-40 (9,61 g) M4-5 (2,3 g) M2-3 (10,67 g)
CC silica gel, CHCl3/MeOH
A13-50 (300 mg) C23-26
(300 mg)
CC silica gel, CHCl3/MeOH
C32-34 (800 mg) D19-41 Kết tinh Kết tinh ITS03 (340 mg) ITS05 (13,9 mg)
4.2. Xác định cấu trúc hợp chất
4.2.1. Hợp chất ITS01: Ilekudinoside R
Hợp chất ITS01 thu được dưới dạng kết tinh không màu, tan nhiều trong methanol, kết tinh trong hệ dung môi CHCl3 : MeOH (9 : 1). Trên bản mỏng không hiện màu ở nhiệt độ thường, đốt trong H2SO4 10% có màu tím.
Phổ IR (KBr) (hình 4.2) của ITS01 cho thấy ở 3417 cm-1 xuất hiện peak tròn,
đây là tín hiệu chứng tỏ sự có mặt của nhóm -OH (có nhóm chức ancol). Ở 1729 cm-1 có tín hiệu hấp thụ của nhóm este (-COO). Ở 2943 cm-1 có peak nhọn của C-H alkan.
Hình 4.2. Phổ IR của hợp chất ITS01.
Phổ 1
H-NMR (hình 4.3) của ITS01 cho thấy sự có mặt của 7 nhóm CH3 bậc ba
[H0,85 (s, 3H); 0,86 (s, 3H); 0,97 (s, 3H); 1,05 (s, 3H); 1,35 (s, 3H); 1,36 (s, 3H); 1,37 (s, 3H)] và một cặp tín hiệu doublet của một nhóm CH3 bậc hai [H 1,25 (d, 6,5Hz, 3H)]. 2 cặp tín hiê ̣u của proton anomeric của đường xuất hiê ̣n ở H 4,58 (d, 4,5 Hz, 1H) và 5,13 (s, 1H). Tín hiệu tại H 5,46 (brs, 1H) là của proton thuộc nhóm methin liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy >CH-OH. Tín hiệu ở H 3,17 (dd, 11,5; 4,5Hz, 1H) rất đặc trưng cho H-3 của hợp chất triterpen.
ITS01 2 4 6 8 10 12 14 16 18 % T r a n s m it ta n c e 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Wavenumbers (cm-1)
Phổ 13C-NMR (hình 4.4) và phổ DEPT (hình 4.5) của ITS01 cũng cho thấy sự có mặt của 41 tín hiệu carbon, trong đó có 8 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 13 nhóm CH và 10 C. Hai tín hiệu của carbon anomeric tại C 104,78 và 102,04 ppm khẳng định sự có mặt của hai đơn vị đường.Tín hiệu cộng hưởng tại C 177,67 ppm cho thấy có một nhóm ester (COO) trong cấu trúc. Hai tín hiệu carbon tại C 138,54 và 147,27 ppm khẳng định sự tồn tại của một liên kết đôi. 7 tín hiệu carbon methin (CH) của 2 đơn vị đường xuất hiện trong vùng C từ 67,58 đến 76,87 ppm. Hai nhóm methin liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy không phải của đường cô ̣ng hưởng ở C 90,54 và 86,99 ppm.
Hình 4.4. Phổ 13C-NMR của ITS01.
Hình 4.5. Phổ DEPT của ITS01.
Hình 4.6. Phổ khối của hợp chất ITS01.
Từ các đặc trưng phổ nói trên, dự kiến ITS01 là một saponin triterpen có cấu trúc khung -kudinlactone liên kết với một mạch đường gồm 2 đơn vị đường là rhamnose và arabinose tại vị trí C-3. Các giá trị phổ 1H- và 13C-NMR của các vị trí được gán chính xác nhờ vào các phổ hai chiều 2D-NMR. Phổ HSQC (hình 4.7) đã giúp xác định các giá trị độ dịch chuyển hoá học H từ các giá trị C của các carbon có mang proton trong cấu trúc và được thể hiện ở bảng 4.1. Các tương tác xa HMBC (hình 4.8) giữa H với C đã giúp khẳng định các giá trị độ dịch chuyển hóa học của các vị trí C và H. Liên kết với các đơn vị đường được xác nhận nhờ các tương tác HMBC giữa proton anomeric (H-1’) của arabinose (δH 4,58 ppm) với C-3 của -kudinlactone (δC 90,54 ppm), H-1” của rhamnose (δH 5,13 ppm) với C-2’ của arabinose (δH 76,87 ppm).
Hình 4.7. Phổ HSQC của ITS01.
Hình 4.8. Phổ HMBC của ITS01.
Các số liệu ph ổ NMR của hợp chất ITS01 được so sánh với s ố liệu đã công bố cho 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl--kudinlactone[23] (bảng 4.1) là hoàn toàn phù hợp.
Phổ ESI-MS (hình 4.6) của ITS01 cho thấy pic ion [M+HCl]- tại m/z 800,3
tương ứng với công thức phân tử C41H64O13 (M = 764) của hợp chất này.
Từ những bằng chứng phổ nêu trên, hợp chất ITS01 được xác định là
3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl--kudinlactone hay
ilekudinoside R, có cấu trúc như hình 4.9. Hợp chất này đã được phân lập từ loài
Ilex kudingcha [13, 22]. Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-
(1→2)-α-L-arabinopyranosyl--kudinlactone được phân lập từ loài Ilex triflora.