Chuột nhắt trắng chủng NMRI, cân nặng 18-20 gam, hoặc chuột cống chủng Lewis cân nặng 180-200 gam.
Hồng cầu cừu được dùng làm kháng nguyên, hoặc có thể dựng cỏc chất sau đây làm mitogen:
+ Lipopolysaccharide nồng độ 0,1-10 àg/ml + Dextran sulfat nồng độ 7,5 - 30 àg/ml + Phytohaemagglutinin nồng độ 0,12 – 0,5 àg/ml + Concanavallin A nồng độ 0,12 – 0,5 àg/ml
Các thuốc thường được dùng làm thuốc chuẩn trong lô súc vật đối chứng dương là: levamisol, cycloporin A, prednisolon, leflunomid. - Trên ex vivo:
Các súc vật được dùng thuốc thử mỗi ngày một lần trong 5 ngày liên tục. Sau khi dùng thuốc thử đủ ngày, lấy tổ chức lỏch, tỏch lấy tế bào (Hỗn dịch chứa 5x 106 tế bào/ml). Các mitogen được đưa vào các giếng nuôi cấy. Ủ ấm và nuôi cấy tế bào trong điều kiện chuẩn: nhiệt độ 37oC, trong không khí có 5 % khí CO2, thời gian nuôi cấy 48- 60 giờ. Thêm 0,25 àC +3H-thymidin vào các giếng nuôi cấy. Thu hoạch các tế bào bằng dụng cụ lọc thủy tinh chuyên biệt, làm khô và định lượng.
- Đánh giá: chỉ số kích thích tăng quá trình biệt hóa được so sánh giữa cỏc lụ súc vật nghiên cứu: lô chuẩn đối chứng dương, đối chứng õm, lụ chứng sinh học và lụ dựng thuốc thử.
2.2.4. Nghiên cứu đánh giá sự tăng sinh của tế bào lympho T (T cellproliferation) [25] proliferation) [25]
- Nguyên lý:
Các tế bào lympho T sẽ tăng biệt hóa khi được kích thích bới kháng nguyên đặc hiệu. Dựng cỏc tác nhân khác nhau làm suy giảm về số lượng và chức năng của các tế bào lympho T, sau đó gián tiếp định lượng các tế bào lylpho T bằng phương pháp đánh dấu phóng xạ (+3H- thymidin) và chất tiết đặc hiệu của chúng là IL-2 bằng phương pháp ELISA.
- Tiến hành: các tế bào lympho máu ngoại vi gồm cả tế bào B và T. Dùng kháng CD3 (phân tử CD3 là một tổ hợp gồm 4 chuỗi peptid có trọng lượng phân tử từ 20-26 kD, phân tử CD3 có mặt ở mọi tế bào T chín) hoặc kháng CD28 để cô lập các tế bào T. Sau đó ủ và nuôi cấy các tế bào T với kháng nguyên đặc hiệu trong các giếng nuôi cấy tế
bào. Thêm vào các giếng 1 àC +3H-thymidin để gián tiếp định lượng số lượng các tế bào lympho T. Dùng phương pháp ELISA để định lượng interleukin-2 receptor (IL-2R).
- Đánh giá: IL-2 là cytokin quan trọng, được sản xuất bởi các tế bào Th. Dưới tác dụng của IL-2 các tế bào lympho T tăng cường phân chia và biệt hóa. IL-2R gồm 2 chuỗi peptid (chuỗi α: trọng lượng phân tử 75 kD và β: 55 kD). Các tế bào T khi nghỉ chỉ có một ít chuỗi α, hầu như không còn chuỗi β. Những receptor cú ỏi tớnh cao với IL-2cú khả năng cảm ứng sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào T. Receptor cú ỏi tớnh thấp với IL-2 chỉ có chuỗi β, chỳng khụng hoạt hóa được tế bào T.
Dựa vào đường cong chuẩn nồng độ xác định ở các giếng nuôi cấy, so sánh với cỏc lụ súc vật dùng thuốc thử hoặc lô đối chứng.
2.2.5. Nghiên cứu đánh giá quầng dung huyết trên in vitro (Plaqueforming colony test in vitro) [2, 25]. forming colony test in vitro) [2, 25].
- Nguyên lý: xác định tỷ lệ tế bào lympho lách tiết kháng thể kháng hồng cầu cừu (HCC) theo kỹ thuật của Cuinningham.
- Tiến hành: trộn các lympho bào của lách chuột đã được mẫn cảm với kháng nguyên là HCC từ trước với HCC theo tỷ lệ thích hợp kèm theo sự có mặt của bổ thể trong một buồng đếm gắn kín. Khi gặp kháng nguyên đặc hiệu, các tế bào lympho B đã biệt hoá thành các tương bào sẽ tiết kháng thể hoà tan vào môi trường xung quanh và những kháng thể này sẽ kết hợp với các kháng nguyên là HCC. Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hoạt hoá bổ thể làm tan các HCC xung quanh các tế bào B tiết kháng thể, tạo ra vòng trắng không có HCC ở xung quanh các tế bào này. Đây gọi là tế bào tạo quầng dung huyết. Đếm các tế bào lympho tạo quầng dung huyết trong tổng số 100 tế bào lympho lách dưới kính hiển vi độ phóng đại 10 x 40. Từ đó tính được tỷ lệ phần trăm tế bào tạo quầng dung huyết ở các lô thí nghiệm.
- Đánh giá:
Các lympho bào B khi được mẫn cảm với kháng nguyên đặc hiệu sẽ phân chia và biệt hoá nhanh chóng thành các tương bào sản xuất các kháng thể. Vì vậy, súc vật đã được mẫn cảm bởi kháng nguyên là hồng cầu cừu, sau đó ủ các tế bào lympho B này với hồng cầu cừu, sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên và kháng thể, với tác dụng của bổ thể sẽ làm dung giải những hồng cầu cừu xung quanh tế bào lympho và tạo thành quầng dung huyết. Tỷ lệ tế bào tạo quầng dung huyết không những đánh giá được khả năng tiết kháng thể đặc hiệu của các lympho B mà còn đánh giá được các thụ thể bề mặt của tế bào này với C3 của bổ thể.
2.2.6. Phản ứng bì với kháng nguyên OA [2, 25]
- Nguyên lý: Thí nghiệm thường được tiến hành trên chuột nhắt trắng, chuột cống trắng. Đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào thông qua phản ứng quá mẫn chậm ở gan bàn chân chuột với kháng nguyên OA.
- Tiến hành: trước khi đo kết quả phản ứng quá mẫn chậm với kháng nguyên OA, tiêm 50 hoặc 100 µl kháng nguyên OA (liều phát hiện) vào một bên gan bàn chân chuột, bên còn lại tiêm thể tích tương tự dung dịch BSA. Sau 24 giờ tiêm kháng nguyên phát hiện, đo bề dày hai gan bàn chân chuột bằng thước palmer. Lấy hiệu số bề dày phản ứng quá mẫn chậm của chuột với kháng nguyên OA và BSA được chỉ số phản ứng với kháng nguyên OA.
- Đánh giá: phản ứng quá mẫn chậm với kháng nguyên OA đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, trong đó các tế bào lympho T đóng vai trũ chớnh. Tại chỗ tiếp xúc với kháng nguyên có sự tập trung rất nhiều các tế bào lympho đặc biệt là các lympho bào T.
Một số các phương pháp nghiên cứu khác như: nghiờn cứu đánh giá sự kết hợp tại các receptor của interferon (binding to interferon receptors), nghiờn cứu sàng lọc các chất đối kháng với IL-1 (screening for interleukin-1
antagonists), nghiờn cứu ức chế enzym chuyển của IL-1β (inhibition of interleukin-1β converting enzym) [25]…
2.2.7. Xác định số lượng các dưới nhúm của lympho bào T
Dùng kỹ thuật miễn dịch hình quang xác định số lượng TCD3, TCD4, TCD8a, TCD8b
- Nguyên lý: các tế bào lympho T có nhiều loại như Th, Tc, Ts, TDTH… mỗi loại có chức năng đặc hiệu và đặc trưng bởi các dấu ấn miễn dịch riêng (các CD) trên bề mặt tế bào. Ví dụ, CD3: đặc trưng cho các tế bào T9 sau khi đã được hoạt hoá bởi các kháng nguyên đặc hiệu, CD4: đặc trưng cho các tế bào T hỗ trợ, trong khi CD8 đặc trưng cho các tế bào T độc (là những tế bào có chức năng quan trọng trong miễn dịch chống tế bào ung thư và virus)
- Tiến hành lấy máu hoặc tổ chức lympho của súc vật bị gõy suy giảm miễn dịch bằng các tác nhõn đặc hiệu (hoá chất, tia xạ…). Đánh giá số lượng các dưới nhúm của lympho bào T bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong máu ngoại vi và trong tổ chức lympho. Xác định tỷ lệ phần trăm tế bào TCD3, TCD4, TCD8a, TCD8b trong tổng số 100 tế bào.
- Đánh giá: các tế bào TCD3 là những tế bào T chín sau khi được mẫn cảm với kháng nguyên đặc hiệu. Phõn tử CD3 của các tế bào T chín liên kết trực tiếp với TCR. Số lượng các tế bào TCD3 tăng tương ứng với khả năng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào được cải thiện.
Các tế bào TCD4 và TCD8 là các quần thể tế bào gõy độc với virus và các tế bào ung thư. Bản thõn chúng có thể tiêu diệt trực tiếp các tế bào ung thư và các tế bào nhiễm virus (TCD8) hoặc gián tiếp thông qua các cytokin do chúng tiết ra như IL-2, TNFα.
2.2.8. Định lượng các cytokin IL-2, TNFα.
Nguyên lý: các tế bào lympho T sau khi được hoạt hoá bởi kháng nguyên sẽ tăng sinh, biệt hoá để trở thành các tế bào T mẫn cảm có chức năng
loại bỏ kháng nguyên đó. Một trong những công cụ quan trọng của các tế bào lympho T mẫn cảm là chất tiết cytokin của chúng. Các cytokin này có tác dụng trực tiếp loại bỏ kháng nguyên (TNFα với tế bào ung thư) hoặc chúng có vai trò khuếch đại dòng thác miễn dịch thông qua việc kích thích các tế bào T hỗ trợ như IL-2. Bản chất của cytokin là các protein được đặc trưng bởi các chuỗi acid amin. Dùng kỹ thuật ELISA để xác định nồng độ của các cytokin trong dịch tiết của các tế bào lympho T được nuôi cấy.
- Tiến hành: lấy tổ chức lympho của súc vật (thường là lách, hạch, tuyến ức) nghiền nhỏ ly tõm, rửa trong các dung dịch đặc hiệu, tách lấy các tế bào lympho khoảng 105 tế bào, các tế bào được nuôi cấy trong khoảng 48giờ với PHA 3µg/ml.
- Đánh giá: IL-2 là cytokin quan trọng bậc nhất có tác dụng là tăng sinh và biệt hoá các lympho bào T, hoạt hoá các tế bào T độc, hoạt hoá đại thực bào, có vai trò quan trọng trong miễn dịch chống ung thư và chống virus. TNFα có nhiều nguồn gốc khác nhau như từ đại thực bào, tế bào mast, tế bào lympho… nên ít đặc hiệu hơn so với IL-2, TNFα có phạm vi tác dụng rộng hơn trong đó có cả tác dụng gõy độc tế bào ung thư và tế bào nhiễm virus do tăng biểu lộ các phõn tử MHC lớp I cho các tế bào T độc hoạt động.
2.3. Các chỉ số dùng để đánh giá suy giảm miễn dịch thực nghiệm
2. 3. 1. Các chỉ số chung:
Trọng lượng cơ quan lympho (lách, tuyến ức, hạch) số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi, tiêu bản giải phẫu bệnh các cơ quan lympho....
Trọng lượng lách hoặc tuyến ức tương đối =
Trọng lượng lách hoặc tuyến ức Thể trọng súc vật
2.3.2. Các chỉ số đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể:
Định lượng các γ globulin, các lớp Ig, các kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đã được mẫn cảm, số lượng và tỷ lệ tế bào lympho B tiết kháng thể đặc
hiệu, tế bào tạo hoa hồng mẫn cảm, khả năng tạo cụm tế bào lympho B khi nuôi cấy với các chất kÝch thích phân bào.
2. 3. 3. Các chỉ số đánh giá đáp ứng miễn dịch tế bào:
Phản ứng quá mẫn chậm ở da thông qua ghép da dị gen, phản ứng bì với kháng nguyên đặc hiệu, số lượng tế bào lympho T, các dưới nhóm của lympho T (Th, Ts, Tc, TCD4+, TCD8+...) trong máu hoặc trong các tổ chức lympho, khả năng gây độc tế bào của lympho Tc, khả năng tiết các lymphokin của tế bào lympho T mẫn cảm như interleukin, interferon, yếu tố hoại tử khối u ...
Tiếng Việt
1. Phan Sĩ An (1995), "Tương tác của bức xạ ion với vật chất và tác dụng của bức xạ
ion hoá", Tài liệu tập huấn Quốc gia an toàn phóng xạ trong Y tế, Bé Khoa học Công nghệ và môi trường và Bộ Y tế phối hợp tổ chức.
2. Vũ Triệu An (1997), Miễn dịch học, Trường Đại học Y Hà Nội, Nhà xuất bản Y
học.
3. Bộ môn Dược lý (2007), Dược lý học, Trường Đại học Y Hà Nội, Nhà xuất bản Y
học.
4. Bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh (2007), Sinh lý bệnh và miễn dịch,Trường Đại học
Y Hà Nội, Nhà xuất bản Y học.
5. Bộ môn Y học hạt nhân (2007), Bài giảng Y học hạt nhân, Trường đại học Y Hà
Nội, Nhà xuất bản Y học.
6. Bé Y tế (2006), Dược thư quốc gia Việt Nam, Hội đồng Dược điển Việt Nam. 7. Đào Văn Chinh, Nguyễn Quốc Tuấn, Phạm Văn Thức (2002), Miễn dịch học lâm
sàng, Nhà xuất bản Y học.
8. Nguyễn Bá Đức (2003), Thực hành xạ trị bệnh ung thư, Nhà xuất bản Y học.
9. Nguyễn Thị Vinh Hà, Phạm Huy Quyến, Phan Thị Phi Phi (1994), “Về mô hình gây
suy giảm miễn dịch thực nghiệm”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Đại học Y Hà Nội, 5, tr. 16-17.
10. Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử Dương(2001), Xét nghiệm sử dụng trong lâm sàng,
Nhà xuất bản Y học.
11. Phan Thị Phi Phi (2007), Một số vấn đề y sinh học cập nhật cho bác sĩ, Nhà xuất
overview of immune response among the atomic-bomb survivors", Int. J. Radiat. Biol., Japan, 68(5), pp. 497 - 508.
13. Banks W.A., Farr S.A., Morley J.E. (2003), “Entry of blood-borne cytokines in the
central neurvous system: effect on cognitive processes”, Neuro immuno modulation, 10(6), pp. 319 - 327.
14. Bertram G.K. (1998), Basic and clinical pharmacology, Karolinska Institutets
Bibliotek, pp. 917-944.
15. Birkeland S. A. (1980), "Influence of irradiation on the capacity of human T and B
lymphocytes to from E and EAC rosettes", Transplantation, 29, pp. 23 - 24.
16. Bourgeois C; Rocha B; Tanchot C (2002), A role for CD40 expression on CD8+ T
cells in the generation of CD8+ T cell memory, Science, 297(5589):2060-3.
17. Castigli E; Wilson SA; Garibyan L; Rachid R; Bonilla F; Schneider L; Geha RS
(2005), TACI is mutant in common variable immunodeficiency and IgA deficiency, Nat Genet, 37(8):829-34.
18. Castigli E; Wilson SA; Scott S; Dedeoglu F; Xu S; Lam KP; Bram RJ; Jabara H;
Geha RS (2005), TACI and BAFF-R mediate isotype switching in B cells, J Exp Med, 201(1):35-9.
19. Chang C.C., Naiki M., Halpern G.M., Gershewin M.E. (1993), "Pharmacological
regulation of the immune system", J. Investig. Allergol. Clin. Immunol, 3, pp. 8-18.
20. Cosman D. (1998), "Colony stimulating factors invivo and invitro", Immunology
today.
21. Doan T., Melvold R., Waltenbaugh C. (2005), Medical Immunology, Lippincott
Willams and Wilkins.
22. Ferrari S; Plebani A (2002), Cross-talk between CD40 and CD40L: lessons from
primary immune deficiencies, Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2(6):489-94.
23. Fooksman DR; Gronvall GK; Tang Q; Edidin M (2006), Clustering class I MHC
modulates sensitivity of T cell recognition, J Immunol, 176(11):6673-80.
24. Gatto D; Martin SW; Bessa J; Pellicioli E; Saudan P; Hinton HJ; Bachmann MF
(2007), Regulation of memory antibody levels: the role of persisting antigen versus plasma cell life span, J Immunol, 178(1):67-76.
25. Gehard Volgel H. (2002), Drug discovery and evaluation, Pharmacological assays,
edition), pp.1463-1484.
28. Gutierrez T., Berber A. (2001), “Safety and efficacy of two courses of OM-85
Bronchovaxom in the prevention of respiratory tract infections in children during 12 months”, Chest Journal, Jun, 119(6), pp. 1742 - 1748.
29. Hans D. Ochs, C. I. Edvard Smith, Jennifer M. Puck (2007), Primary Immuno
deficiency Diseases: A Molecular and Genetic Approach, Second Edition, Oxford university press.
30. Hendry J. H. (1985), "The cellular basis of long term marrow injury after
irradiation". Radiother. Oncol. Vol. 3, pp. 331 - 338.
31. Huggins J; Pellegrin T; Felgar RE; Wei C; Brown M; Zheng B; Milner EC;
Bernstein SH; Sanz I; Zand MS (2007), CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naive human B cells, Blood, 109(4):1611-9.
32. Knoechel B; Lohr J; Zhu S; Wong L; Hu D; Ausubel L; Abbas AK (2006),
Functional and molecular comparison of anergic and regulatory T lymphocytes,
J Immunol, 176(11):6473-83.
33. Krogsgaard M; Li QJ; Sumen C; Huppa JB; Huse M; Davis MM (2005),
Agonist/endogenous peptide-MHC heterodimers drive T cell activation and sensitivity, Nature, 434(7030):238-43.
34. Kuppers R (2003), B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-
Barr virus, Nat Rev Immunol, 3(10):801-12.
35. Lieberman J (2003), The ABCs of granule-mediated cytotoxicity: new weapons in
the arsenal, Nat Rev Immunol, 3(5):361-70.
36. McHeyzer-Williams LJ; McHeyzer-Williams MG (2005), Antigen-specific memory
B cell development, Annu Rev Immunol, 23:487-513.
37. Mills DM; Cambier JC (2003), B lymphocyte activation during cognate interactions
with CD4+ T lymphocytes: molecular dynamics and immunologic consequences,
Semin Immunol, 15(6):325-9.
38. Niedbala W; Wei XQ; Cai B; Hueber AJ; Leung BP; McInnes IB; Liew FY (2007),
IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells, Eur J Immunol.37(11):3021-9.