Chỳng ta hóy xem xột mối quan hệ giữa cỏc thứ tự acid amin của một protein và cấu trỳc của nú từ cụng trỡnh kinh điển của Christian Anfinsen trờn Ribonulease. Đú là một chất sớm được chỳ ý, Ribonuclease là một chuỗi polypeptide gồm 124 gốc acid amin, 4 liờn kết disulfide cú thể bị cắt đi do việc khử chỳng với một thuốc thử nhưβ-mercaptoethanol nú sẽ
hỡnh thành disulfide hỗn hợp với chuỗi bờn Cystein (hỡnh 1..22).
Khi cho dư nhiều β-mercaptoethanol thỡ cỏc disulfide hỗn hợp cũng bị khử, sản phẩm cuối cựng là 1 protein trong đú disulfide (Cystin) được chuyển hoàn toàn thành sulfhydryl (Cysteine). Tuy nhiờn, người ra cũng phỏt hiện rằng Ribonuclease ở 37°C và pH 4 lại khụng bị khử bởi β-mercaptoethanol trừ phi protein này được xử lý với cỏc thuốc thử như urea hoặc guanidine hydrochloride. Mặc dầu cơ chế tỏc động của cỏc tỏc nhõn này chưa được rừ hoàn toàn, nhưng đó rừ ràng là chỳng làm rối loạn cỏc tương tỏc khụng đồng hoỏ trị. Hầu hết cỏc chuỗi peptide đều khụng cú cỏc liờn kết chộo để thừa nhận một cấu trỳc cuộn ngẫu nhiờn trong urea 8M hoặc Guanidine HCl 6M.
Khi Ribonuclease được xử lý với β-mercaptoethanol trong urea 8M thỡ sản phẩm là một chuỗi polypeptide cuộn lại một cỏch ngẫu nhiờn và bị khử hoàn toàn, nú khụng cú hoạt tớnh Enzyme. Núi một cỏch khỏc, Ribonuclease đó bị biến tớnh do sự xử lý này (hỡnh 1..23).
Sau đú Anfisen đó cú những quan sỏt đặc biệt về Ribonuclease đó bị biến tớnh khi loại trừ urea và β-mercaptoethanol bằng thẩm tớch thỡ hoạt tớnh Enzyme lại được phục hồi một cỏch chậm chạp. ễng đó lĩnh hội được ý nghĩa của sự phỏt hiện tỡnh cờ này là: Sulfhydryl của cỏc Enzyme đó bị biến tớnh sẽ bị oxi hoỏ bởi khụng khớ và Enzyme này lại cuộn lại một cỏch tự phỏt trong dạng hoạt hoỏ xỳc tỏc. Những nghiờn cứu chi tiết sau đú đó chỉ ra rằng hầu như
tất cả hoạt tớnh Enzyme gốc (original) sẽ được khụi phục nếu nhúm sulfhydryl bị oxi hoỏ dưới những điều kiện thớch hợp (hỡnh 1..23). Tất cả cỏc đặc tớnh lý hoỏ của Enzyme cuộn lại phõn biệt rừ ràng với Enzyme nguyờn mẫu (native). Những thớ nghiệm này đó chỉ ra rằng thụng tin
Hỡnh 1.22: Sự khử cầu disulfide trong một protein bằng cỏch cho dư thừa thuốc thử
Trường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ Sinh động vật ……… 25
cần để chuyển hoỏ phức hợp cấu trỳc 3 chiều của Ribonuclease nằm ở trong cỏc thứ tự acid amin. Những nghiờn cứu sau này đó xỏc định một cỏch tổng quỏt nguyờn lý trung tõm của sinh học phõn tử là thứ tự chuyờn hoỏ cỏc cấu trỳc hoỏ học. Một kết quả khỏc thu được khi Ribonuclease đó khử sẽ bị oxi hoỏ khi ở urea 8M. Chế phẩm này sau đú được thẩm tớch để
loại urea. Ribonuclease bị tỏi oxi hoỏ theo cỏch này chỉ cú hoạt tớnh Enzyme 1%.
Hỡnh 1.23. Sự hoàn nguyờn của ribonuclease
Tại sao kết quả của thớ nghiệm này khỏc với kết quả trong đú Ribonuclease đó bị khử sẽ
lại tỏi oxi hoỏ trong dung dịch khụng cú urea? Lý do là tạo vũng đụi disulfide khụng đỳng (wrong) ở phõn tử khử khi bị tỏi oxi hoỏ vỡ cú tới 105 cỏch của 8 vũng đụi Cystein để hỡnh thành 4 disulfide; nhưng chỉ cú một trong số cỏc hợp chất này là cú hoạt tớnh Enzyme. 104 vũng đụi sai cú tờn là Ribonuclease "leo trốo" (Scramble). Sau đú Anfinsen đó thấy cỏc Ribonuclease “leo trốo” này chuyển đổi một cỏch tự phỏt thành Ribonuclease nguyờn mẫu,
đầy đủ hoạt tớnh khi cho vào một ớt β-mercaptoethanol trong dung dịch nước (hỡnh 1..23). β- mercaptoethanol được thờm vào sẽ xỳc tỏc sự sắp xếp lại của cỏc vũng đụi disulfide cho đến khi cấu trỳc ban đầu được hoàn nguyờn, thời gian mất khoảng 10 giờ. Quỏ trỡnh này được thực hiện hoàn toàn bởi việc làm giảm năng lượng tự do nhờ cấu trỳc "leo trốo" đó chuyển thành cấu trỳc của Enzyme. Như vậy, dạng ban đầu của Ribonuclease là cấu trỳc ổn định nhất về nhiệt động học. Tuy nhiờn, điều quan trọng là việc cuộn lại của nhiều Enzyme lại được sự
trợ giỳp bởi Enzyme, nú xỳc tỏc để đạt tới trạng thỏi năng lượng thấp nhất.
Sự hoà hợp như thế nào của tương tỏc trung gian để tạo nờn sự chuyển ngược từ dạng khụng cuộn sang dạng cuộn của một protein? Cấu trỳc của một protein cú thể được suy luận
từ cỏc thứ tự acid amin của nú được khụng? Những vấn đề này là trung tõm của hoỏ sinh phõn tử.
Anfinsen (1964) viết: “Cỏi đập vào tụi gần đõy là người ta cú thể thật sự thấy được cỏc thứ tự của một phõn tử protein, về sự cuộn lại trong một dạng hỡnh học chớnh xỏc giống như
một hàng chữ viết đẹp đẽ trong dạng quy chuẩn và sự tạo mẫu với bản chất cuộn lại của nú, tạo nờn sự hoà hợp với chức năng sinh học”.