Xác định được loại hóa chất và thời gian khử trùng thích hợp đối với Keo lá tràm Clt43 và Clt98.
Xác định được môi trường nhân chồi, môi trường ra rễ in vitro phù hợp cho 2 giống Keo lá tràm Clt43 và Clt98.
Xác định được thời gian huấn luyện thích hợp cho Keo lá tràm Clt43 và Clt98.
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Tiến hành nghiên cứu nhân giống cho hai dòng Keo lá tràm Clt43 và Clt98. Đây là những dòng có khả năng sinh trưởng nhanh, chống chịu sâu bệnh và chịu hạn tốt; đã được tuyển chọn và được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật theo quyết định số 2763/QĐ-BNN-LN, ngày 1 tháng 10 năm 2009.
- Việc nghiên cứu và bố trí thí nghiệm được triển khai tại phòng nuôi cấy mô của Trung tâm thực nghiệm và chuyển giao giống cây rừng - Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp.
2.3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu các nội dung nghiên cứu được tiến hành bao gồm:
sạch và mẫu tái sinh chồi cho 2 dòng Keo lá tràm Clt43 và Clt98;
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi của Keo lá tràm Clt43 và Clt98;
Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của Keo lá tràm Clt43 và Clt98;
Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng than hoạt tính (AC) đến khả năng hình thành chồi và chất lượng chồi hữu hiệu của Keo lá tràm Clt43 và Clt98;
Nghiên cứu ảnh hưởng của Auxin đến khả năng ra rễ của Keo lá tràm Clt43 và Clt98;
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Vật liệu nuôi cấy
Các chồi bánh tẻ được thu từ cây vật liệu gốc 1 - 1,5 tuổi của các dòng Keo lá tràm Clt43 và Clt98 đã được xử lý tạo chồi tại vườn ươm Trung tâm thực nghiệm và chuyển giao giống cây rừng.
2.4.2. Điều kiện bố trí thí nghiệm nghiên cứu
Điều kiện thí nghiệm tuân theo tiêu chuẩn và quy định kỹ thuật của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô:
- Số giờ chiếu sáng trong ngày là 10 - 12 h/ngày; - Cường độ ánh sáng khoảng 2.000 - 3.000 lux; - Nhiệt độ phòng nuôi là 25 - 280C;
- Môi trường nuôi cấy hấp ở áp suất 1,2 atm; nhiệt độ 1210C trong thời gian từ 20 phút;
nhiệt độ từ 1210C trong thời gian 40 phút;
- pH của môi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở 5,8.
2.4.3. Phương pháp tiến hành
Phương pháp tiến hành kế thừa quy trình nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng/chồi bất định cho các đối tượng (Theo Lê Đình Khả, Hà Huy Thịnh, Nguyễn Ngọc Tân, Đoàn Thị Mai). Phương pháp này bao gồm các bước cụ thể như sau:
Giai đoạn khử trùng và tái sinh chồi ban đầu
- Vật liệu dùng trong nuôi cấy là những chồi bất định các dòng Keo lá tràm Clt43 và Clt98 đã được xử lý tạo chồi tại vườn ươm Trung tâm thực nghiệm và chuyển giao giống cây rừng, các mẫu này được cắt vào buổi sáng các ngày nắng. Sau khi cắt, mẫu được ngâm trong cốc nước để tránh hiện tượng mất nước. Thời gian cắt mẫu thường vào đầu buổi sáng của những ngày nắng ráo.
- Khử trùng mẫu vật:
+ Cắt bỏ lá chú ý để lại một phần cuống lá không cắt xát thân rồi rửa mẫu vật dưới vòi nước chảy bằng chổi lông mềm;
+ Vật liệu được rửa bằng nước rửa chén sunlight 50%, rồi rửa lại dưới vòi nước chảy;
+ Tráng qua nước cất 5 - 7 lần;
+ Tráng mẫu vật bằng cồn 70% trong khoảng 1 phút sau đó tráng lại nước cất khử trùng 2 - 3 lần;
+ Lắc mẫu trong dung dịch khử trùng ở các khoảng thời gian khác nhau, tiếp đó dùng nước cất tráng lại 5 - 7 lần bằng nước cất đã được hấp khử trùng;
+ Cuối cùng dùng panh và dao cắt vật liệu thành các đoạn mẫu dài 2 - 4 cm, có ít nhất 1 mắt ngủ rồi cấy vào môi trường tái sinh chồi ban đầu là môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 30 g/l đường; 5,5 g/l agar.
- Tiến hành các thí nghiệm ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng để xác định môi trường nhân chồi tối ưu cho từng đối tượng nghiên cứu.
- Thời gian cho một chu kỳ cấy nhân chồi là 25 đến 30 ngày.
Giai đoạn nâng cao chất lƣợng chồi
- Sau khi đã chọn được môi trường nhân chồi tối ưu cho đối tượng nghiên cứu, tiến hành bổ sung than hoạt tính vào môi trường với hàm lượng khác nhau để tạo ra số lượng và chất lượng chồi đa trước khi bước vào giai đoạn ra rễ (giai đoạn tiền ra rễ).
Giai đoạn ra rễ
- Chuyển mẫu nuôi cấy từ môi trường nâng cao chất lượng chồi sang môi trường tạo rễ để có được cây hoàn chỉnh. Các chồi đạt tiêu chuẩn sẽ được nuôi cấy trong môi trường ra rễ.
- Sau khi rễ dài 1 cm, cây con được đưa ra ngoài nhà huấn luyện để thích nghi với điều kiện tự nhiên bên ngoài để cấy vào bầu đất.
Giai đoạn huấn luyện ngoài vƣờn ƣơm
- Sau khi rễ dài 1 cm, cây con được đưa ra ngoài nhà huấn luyện để thích nghi với điều kiện tự nhiên bên ngoài để cấy vào bầu đất.
2.4.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.4.4.1. Xác định chế độ khử trùng thích hợp cho tỷ lệ mẫu sạch và tái sinh chồi đối với Keo lá tràm Clt43 và Clt98
Thí nghiệm sử dụng hóa chất HgCl2 ở nồng độ và thời gian khác nhau: HgCl2 0,1% và HgCl2 0,05% trong thời gian 3; 5; 7 và 9 phút. Thí nghiệm tiến hành với 3 lần lặp, 30 mẫu cho một lần lặp.
Chỉ tiêu theo dõi: số mẫu sống, số mẫu chết, số mẫu nhiễm, số mẫu nảy chồi.
2.4.4.2. Ảnh hưởng của các Cytokinin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu
Ảnh hưởng của BAP (6 - Benzyl Amino Purine) đên hệ số nhân chồi
- Thí nghiệm tiến hành các dòng Keo lá tràm được bố trí với BAP ở các nồng độ: 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l.
- Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 mẫu.
- Chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi (HSNC) lần, chiều dài trung bình chồi (cm).
Ảnh hưởng phối hợp của BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ
chồi hữu hiệu
- Sau khi tìm được môi trường nhân chồi tốt nhất của thí nghiệm về ảnh hưởng của nồng độ BAP ở trên, tiến hành bổ sung Kinetin ở các mức nồng độ khác nhau: 0,25; 05; 0,75 và 1,0 mg/l.
- Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 mẫu.
- Chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi (HSNC) lần, tỷ lệ chồi hữu hiệu (chồi có chiều cao trên 2,0 cm, thân lá và ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá).
2.4.4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng than hoạt tính đến khả năng hình thành chồi và chất lượng chồi hữu hiệu
- Từ môi trường nhân chồi tốt nhất của thí nghiệm về ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin tiến hành bổ sung lần lượt than hoạt tính ở các hàm lượng khác nhau: 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 g/l vào môi trường.
- Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 mẫu. - Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ chồi hữu hiệu và chiều cao chồi (cm).
2.4.4.4. Ảnh hưởng của auxin đến khả năng ra rễ
- Thí nghiệm được tiến hành sử dụng IBA (3 - Indole Butyric Acid) ở các nồng độ khác nhau: 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 mg/l.
- Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 mẫu. - Chỉ tiêu theo dõi: số chồi ra rễ, số rễ/cây và chiều dài rễ (cm).
2.4.4.5. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chất lượng cây con
0; 7; 14; 21 ngày để đánh giá tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây cấy ra vườn ươm.
- Thí nghiệm tiến hành với 3 lần lặp, 30 mẫu/lặp.
- Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ cây sống và chiều cao trung bình (cm).
2.4.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
2.4.5.1. Thu thập số liệu
a. Các chỉ tiêu đo đếm trong phòng thí nghiệm
- Giai đoạn khử trùng: Số mẫu sống, số mẫu chết, số mẫu nhiễm và số lượng mẫu bật chồi.
- Giai đoạn nhân chồi: số chồi ban đầu, số chồi mới tạo thành, số chồi/cụm, chiều dài trung bình chồi (cm).
- Giai đoạn ra rễ: Số chồi ra rễ, số rễ/cây, chiều cao cây (cm).
- Chồi hữu hiệu là chồi có chiều cao trên 1,5 cm, thân lá và ngọn ro ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không có mô sẹo.
- Chiều dài trung bình của rễ. Chồi ra rễ có chiều dài > 0,3 cm được coi là ra rễ, ngược lại chồi có rễ < 0,3 cm được coi là không ra rễ.
b. Các chỉ tiêu tính toán
Tỷ lệ mẫu sống (%) =
Mẫu sống
x 100 Mẫu ban đầu
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =
Mẫu nhiễm
x 100 Mẫu ban đầu
Tỷ lệ mẫu bật chồi hữu hiệu (%) =
Mẫu nảy chồi
x 100 Mẫu sống
Số chồi của mẫu
TLCHH (%) =
Chồi đủ tiêu chuẩn cho ra rễ
x 100 Chồi tạo được
Chiều cao TB của chồi
(cm) =
chiều cao của chồi
x 100 số chồi đo đếm
Tỷ lệ chồi ra rễ (%) =
Chồi ra rễ
x 100 Chồi nuôi cấy
Số rễ trung bình (cái/cây) =
Số rễ
x 100 Chồi ra rễ
Chiều dài trung bình của rễ (cm) =
Chiều dài của rễ
x 100 Số rễ đo đếm
2.4.5.2. Xử lý số liệu
Số liệu thu được ở các thí nghiệm nghiên cứu của đề tài, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố bằng phần mềm Excel và SPSS 11.5 (Nguyễn Hải Tuất, Nguyễn Trọng Bình, 2005). Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm và tìm ra công thức thí nghiệm tốt nhất:
- Giả thuyết Ho: Nhân tố A có tác động một cách đồng đều (ngẫu nhiên) đến kết quả thí nghiệm khi đó:
1 = 2 = …. = a = 0 hoặc 1 = 2 = … = a =
- Giả thuyết H1: Tác động của nhân tố A là không đồng đều ở tất cả các cấp khi đó có một i 0.
n A V a V a n F (( 1)) (2.1)
Trong đó: VA là biến động giữa các trị số trung bình mẫu.
c x n V V V a i i i N T A 1 2 (2.2)
- VT là biến động toàn bộ của n trị số quan sát.
c X V a j i n Þ ij T i 1 2 (2.3)
- VN là biến động giữa các trị số quan sát cùng một mẫu. 1 2 1 2 i i i a l i ni Þ ij N X a n X c V (2.4)
Nếu FA ≤ F0.5 tra bảng với bậc tự do k1 = a - 1 và k2 = n – a thì nhân tố A tác động đồng đều lên kết quả thí nghiệm.
Nếu FA > F0.5 tra bảng với bậc tự do k1 = a - 1 và k2 = n - a thì nhân tố A tác động không đồng đều đến kết quả thí nghiệm.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định chế độ khử trùng thích hợp cho các dòng Keo lá tràm
Để một quy trình nhân giống in vitro thành công thì khâu vào mẫu là rất quan trọng bởi vì mẫu được đưa vào nuôi cấy phải là những mẫu sạch.
Đến nay các dung dịch khử trùng thường dùng là Clorua thuỷ ngân (HgCl2), Hypochlorite sodium (NaClO), Hypochlorite calcium [Ca(OCl)2], Oxy già (H2O2), Nitrate bạc (AgNO3) và một sô chất kháng sinh… cũng có thể bổ sung thêm Tween 20, Tween 80… để tăng độ xâm nhập và bám dính của các chất diệt khuẩn lên bề mặt mẫu cấy. Tuy nhiên, tỷ lệ vô trùng thành công không những chỉ phụ thuộc vào loại chất khử trùng được sử dụng, mà còn phụ thuộc nồng độ và thời gian tiến hành khử trùng, làm sao vừa đảm bảo tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi cao và chồi tạo được có khả năng sinh trưởng phát triển tốt.
Trong nghiên cứu này, đề tài đã sử dụng hóa chất là HgCl2 ở hai nồng độ khác nhau HgCl2 0,1% và HgCl2 0,05% ở các khung thời gian khác nhau (3, 5, 7 và 9 phút) để xác định được chế độ khử trùng thích hợp cho từng đối tượng. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu bật chồi hữu hiệu. Trong đó, tỷ lệ bật chồi hữu hiệu là chỉ tiêu quan trọng nhất trong việc quyết định được loại hóa chất và thời gian khử trùng thích hợp nào được lựa chọn.
Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của loại hoá chất và thời gian đến kết quả khử trùng cho Keo lá tràm nghiên cứu được thể hiện tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả thí nghiệm khử trùng tạo mẫu sạch 2 dòng Keo lá tràm Dòng Keo lá tràm Nồng độ chất khử trùng Thời gian (phút) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) TLBCHH (%) TB Sd TB Sd TB Sd Clt43 HgCl2 0,1% 3 88,89 1,53 80,00 3,61 2,5 1,15 5 82,22 2,08 57,78 3,06 10,81 0,58 7 72,22 2,52 44,44 2,52 33,85 1,15 9 65,56 2,08 40,00 1,73 30,51 3,00 HgCl2 0,05% 3 95,56 1,15 81,11 0,58 2,33 0,5 5 93,33 1,00 78,89 2,08 3,57 1,00 7 87,78 1,15 72,22 0,58 13,92 0,58 9 82,22 1,53 64,44 3,06 4,05 1,00 F tính 9,81 12,27 11,00 F tra bảng F (.05;7;16) = 2,65 Clt98 HgCl2 0,1% 3 91,11 0,58 55,56 1,53 12,2 3,06 5 84,44 0,58 42,22 4,16 17,11 1,53 7 72,22 4,04 30,00 3,00 29,23 2,08 9 60 1,00 22,22 3,51 16,67 1,00 HgCl2 0,05% 3 95,56 1,15 81,11 0,58 2,33 0,58 5 93,33 1,00 78,89 2,08 3,57 1,00 7 87,78 1,15 72,22 0,58 16,46 0,58 9 82,22 1,53 64,44 3,06 4,05 1,00 F tính 12,85 19,49 4,92 F tra bảng F (.05;7;16) = 2,65
Từ bảng số liệu thu được cho thấy, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu bật chồi ở các công thức thí nghiệm có sự sai khác rõ rệt (Ftính > F.05). Kết quả thí nghiệm hai dòng Keo lá tràm Clt43 và Clt98 đều đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất là HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút với tỷ lệ chồi hữu hiệu cho hai dòng Keo lá tràm nghiên cứu lần lượt là 33,85% và 29,23%, trong khi tỷ lệ mẫu nhiễm dưới 50% và tỷ lệ mẫu sống đạt trên 70% (cho cả hai đối tượng). Kết quả khử trùng mẫu ở hoá chất HgCl2 0,05% và các khoảng thời gian còn lại không cho kết quả mong muốn.
Biểu đồ 3.1a. Ảnh hƣởng của chất khử trùng đến TLBCHH của dòng Keo lá tràm Clt43
Qua kết quả 3.1 và biểu 3.1a cho thấy, khi khử trùng bằng HgCl2 0,05% và HgCl2 0,1% trong thời gian ngắn (3,5 phút) đều cho tỷ lệ mẫu sống cao (trên 80%), song tỷ lệ mẫu nhiễm cũng cao (hơn 70%), còn khi kéo dài thời gian khử trùng (9 phút) thì cả hai loại hoá chất này làm giảm số lượng mẫu sống cho dù tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, song tất cả điều này đều dẫn đến giảm số mẫu nẩy chồi hữu hiệu, mà đây lại là một chỉ số quan trọng thể hiện sự thành công ở công đoạn đầu tiên của quy trình nhân giống. Việc sử dụng HgCl2 0,1% khử trùng cho các giống Keo lá tràm Bvlt81, Bvlt82, Bvlt83 cũng đã
0 5 10 15 20 25 30 35 3 5 7 9 2,5 10,81 33,85 30,51 2,33 3,57 13,92 4,05 TLBCHH (%) Thời gian (phút) HgCl2 0,1% HgCl2 0,05%
được Đoàn Thị Mai và cộng sự (2003) báo cáo với thời gian khử trùng lâu hơn (8 - 10 phút) mà tỷ lệ bật chồi chỉ đạt 14% thấp hơn so với kết quả của đề