Trong lĩnh vực lâm nghiệp ở Việt Nam, việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu còn rất hạn chế. Cho đến nay, một số công trình nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bạch đàn, keo ở Việt Nam đã và đang được thực hiện. Bên cạnh đó, đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết xuất xứ, nhận biết con lai và bố mẹ, xác định quan hệ họ hàng giữa các loài được thực hiện.
Tổ chức Khoa học và Công nghệ Australia (CSIRO) phối hợp với Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp (2004) để ứng dụng chỉ thị di truyền nghiên cứu hệ thống giao phấn cận huyết trong rừng giống làm nguyên nhân thay đổi tỷ lệ giao phấn cận huyết trong quần thể rừng giống, vườn giống keo tai tượng [28].
Ứng dụng chỉ thị phân tử (RAPD và ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền cho 40 dòng cây trội Keo tai tượng được tuyển chọn tại 5 lâm trường tại Tuyên Quang (trong đó có 34 cây trội và 6 dòng là các xuất xứ Ingham, Mossman, Carwell, Wipim, Pongaki, Iron Range). Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD: OPC10, OPC18, OPC19, OPC20 và OPB17 và 1 gene lục lạp trnL. Kết quả cho thấy 40 dòng Keo tai tượng nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền thấp [2]. Từ kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền của các cây trội, có thể ứng dụng để lựa chọn và bố trí các cặp bố mẹ có quan hệ di truyền xa nhau khi xây dựng vườn giống, nhằm giảm thiểu thụ phấn cận huyết.
Trong giai đoạn 2006-2010, đề tài do Nguyễn Việt Cường làm chủ nhiệm đã ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD và ADN lục lạp nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ Tràm ta (M. cajuputi). Đề tài đã nghiên cứu 12 mẫu cây Tràm ta ở 12 lập địa khác nhau của Việt Nam bằng các chỉ thị RAPD và chỉ thị lục lạp. Nghiên cứu các mẫu trên với các chỉ thị RAPD đã phát hiện được 100 băng đa hình. Đối với các gene lục lạp để phân tích đa hình tác giả đã cắt các sản phẩm PCR của các mồi lục lạp trnH-trnK, trnD- trnT, psbC- trnS, rbcL- psbUA với các enzym giới hạn Himf1, Taq1 thu được 59 băng đa hình. Các số liệu đa hình này được xử lý theo chương trình NTSYS pc để xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền giữa các xuất xứ tràm, kết quả cho thấy: các xuất xứ tràm ở Việt Nam rất đa dạng về mặt di truyền, các xuất xứ tràm ở miền Bắc (Thái Nguyên, Đại Lải – Vĩnh Phúc) có sự khác biệt về di truyền lớn so với các xuất xứ tràm ở miền Trung và miền Nam. Các xuất xứ Quảng Trị vùng đồi và Quảng Trị vùng cát, Đồng Hới và Huế, Đà Lạt và Vũng Tàu có thể là các cặp xuất xứ có cùng nguồn. Cũng trong đề tài này một nghiên cứu khác là bước đầu ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD trong đánh giá sinh trưởng của các giống bạch đàn lai, vật liệu nghiên cứu là 5 dòng bạch đàn trong đó có 4 dòng được đánh là sinh trưởng nhanh sau khảo nghiệm hậu thế (các dòng này đều được công nhận giống tiến bộ kỹ thuật PN2, PN14, U6 và công nhận giống quốc gia UE24) và 1 dòng UE4 luôn luôn có sinh trưởng tương đối thấp từ năm thứ nhất đến năm thứ 6. Mục tiêu nghiên cứu là tìm ra một số chỉ thị phân tử có liên quan đến tính trạng sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm. Qua nghiên cứu tác giả đã tìm ra được 2 chỉ thị là OPC9 và OPB8 cho những phân đoạn có sự khác biệt giữa các dòng sinh trưởng nhanh và chậm. Với mồi OPB8 các mẫu cây bạch đàn sinh trưởng nhanh (UE24, U6, PN2, PN14) đều cho 7 băng, trong khi cây sinh trưởng chậm (UE4) chỉ cho 1 băng (500bp). Tương tự với mồi OPC9 ở
các cây sinh trưởng nhanh đều cho 2 băng (1.300bp và 1.400bp), nhưng ở cây sinh trưởng chậm chỉ cho 1 băng (1.300bp). Như vậy, có thể dùng hai mồi OPB8, OPC9 có thể phân biệt được cây sinh trưởng nhanh và chậm. Tuy nhiên để kết luận được chính xác cần thiết phải tách dòng và đọc trình tự các băng khác biệt này để tìm ra các gene liên quan đến quá trình sinh trưởng và phát triển ở cây bạch đàn, chạy thêm các mồi chỉ thị phân tử, tăng cường số mẫu cây để tăng thêm độ tin cậy và phát hiện thêm sự sai khác di truyền giữa các cây sinh trưởng nhanh và chậm [4].
Ứng dụng của chỉ thị phân tử RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu đa dạng di truyền cho 40 dòng cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận, tên địa phương là cây Cóc hành (Azadirachta excelsa) được tuyển chọn trong rừng khộp tự nhiên khô hạn ở 6 xã của 2 huyện Ninh Sơn và Bắc Ái thuộc tỉnh Ninh Thuận. Chỉ thị phân tử sử dụng là các mồi RAPD: OPC10, OPC18, OPC14, OPC20, OPB17, OPC13 và 2 mồi lục lạp gồm rnH - trnK và atpB -
rbcL. Kết quả cho thấy 40 dòng cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận (Azadirachta excelsa) có mức độ đa dạng di truyền thấp, mặc dù các cây trội được chọn lọc đều ở rừng tự nhiên và có khoảng cách về không gian khá xa. Từ hệ số tương đồng của các dòng cây trội, có thể lựa chọn các cặp bố mẹ có quan hệ di truyền xa nhau khi xây dựng vườn giống nhằm nâng cao khả năng tái tổ hợp những tính trạng có lợi của các cây trong vườn giống khi giao phấn với nhau. Các dòng có quan hệ di truyền quá gần gũi cần phải loại bỏ là X11, X22, X35, X37, X43, X50. Như vậy 34 dòng còn lại vẫn đáp ứng được tiêu chuẩn công nhận giống cây lâm nghiệp TCN 147 -2006 về xây dựng vườn giống [3].
Ở đề tài “ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn giống Keo lá tràm cho vùng Nam bộ” do Vương Đình Tuấn là chủ nhiệm giai đoạn 2005-2009. Đây là nghiên cứu đầu tiên tổng kết về ứng dụng chỉ thị phân tử
trong chọn giống cây rừng nói chung và Keo lá tràm nói riêng ở Việt Nam. Nghiên cứu sử dụng 33 chỉ thị SSR của Keo tai tượng, 12 chỉ thị RAPD và 3 chỉ thị liên quan sinh trưởng nhanh C1, C2, R3; 2 chỉ thị liên quan đến sinh trưởng chậm P1, OS1 để phân tích 100 cá thể Keo lá tràm. Nhưng kết quả của nghiên cứu chưa tìm được chỉ thị SSR liên kết chặt với tính trạng sinh trưởng, và 5 chỉ thị liên quan đến sinh trưởng được sử dụng để nghiên cứu trong quần thể đã cho kết quả không như mục tiêu đặt ra [17].
Năm 2006-2010, đề tài “Nghiên cứu phát triển và ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn giống Bạch đàn uro” do Trần Hồ Quang làm chủ nhiệm đề tài đã phân tích tương quan tính trạng sinh trưởng là đường kính ngang ngực cho dãy allele đơn của 306 cây E. urophylla tại vườn giống với 14 chỉ thị SSR và tìm ra chỉ thị EMBRA57 ở cả hai nhóm allele tương quan có ý nghĩa với tính trạng đường kính cây (EMBRA57_1: có tương quan r = 0,27; mức ý nghĩa P = 0,009; F tính = 6,92; EMBRA57_2: có r = 0,21; P = 0,002; F tính = 9,66). Nhưng khi tác giả gộp hai nhóm allele để xác định mức độ tương quan giữa chỉ thị EMBRA57 với đường kính ngang ngực năm thứ 13 thì tương quan có ý nghĩa (F tính = 9,95; P = 0,003) với tương quan thấp (r = 0,24). Với mức tương quan này, EMBRA57 đóng góp 5,76% trong tổng phương sai kiểu hình về đường kính trong quần thể nghiên cứu. Phân tích tương quan giữa 14 chỉ thị SSR trong nghiên cứu này với tỷ trọng gỗ cũng cho kết quả mức độ tương quan rất thấp (r < 0,1). Trong thí nghiệm kiểm chứng mối tương quan giữa chỉ thị EMBRA57 với đường kính ngang ngực của nhóm sinh trưởng nhanh nhất và chậm nhất thuộc hai tổ hợp lai khảo nghiệm tại Cầu Hai – Phú Thọ cho kết quả tương quan thấp và không có ý nghĩa. Cũng trong nghiên cứu này tác giả đã tách dòng và xác định được trình tự 2 gene sinh tổng hợp lignin (EuCCR và EuCAD2), xác định được các chỉ thị SNP khác biệt giữa 2 nhóm cây có hàm lượng lignin cao và thấp: 6 SNP
khác biệt gene EuCCR và 4 SNP khác biệt cho gene EuCAD2. Xác định được 6 SNP khác biệt giữa hai nhóm cây có hàm lượng xenlulose cao và thấp. Theo tác giả, các chỉ thị SNP này rất có ý nghĩa trong trợ giúp chọn giống sớm về hàm lượng lignin thấp cho E. urophylla [13].
Năm 2010, Trần Đức Vượng đã sử dụng 7 chỉ thị SSR trong nghiên cứu so sánh tỉ lệ thụ phấn chéo giữa Keo tai tượng nhị bội và tứ bội tại vườn giống Bầu Bàng – Bình Dương. Các chỉ thị này đều hoạt động tốt cho cả 2 loài tứ bội và nhị bội. Kết quả cũng cho thấy có sự khác biệt về tỉ lệ giao phấn giữa các dòng nhị bội (97% giao phấn chéo) và tứ bội (2% giao phấn chéo) [18].
Nghiên cứu đánh giá tính đa dạng di truyền của các vườn giống vô tính keo tai tượng cũng đã được Lê Sơn (2012) tiến hành với 8 chỉ thị để đánh giá tính đa dạng di truyền của 100 dòng vô tính thuộc 8 xuất xứ trong các vườn giống Keo tai tượng tại Ba vì (Hà Nội) và Cầu Hai (Phú Thọ). Kết quả cho thấy các xuất xứ trong vườn giống có tính đa dạng di truyền với số allele trung bình là 3,078, số allele hữu hiệu là 2,731. Tỉ lệ giao phối cận huyết trong các vườn giống chỉ khoảng 14% [14].
Năm 2009-2012, đề tài nghiên cứu của Trần Thanh Trăng “Chọn giống Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) kháng bệnh đốm lá (Cryptosporiopsis eucalypti) bằng chỉ thị phân tử” cũng đã thu được một số kết quả nhất định. Tuy nhiên, trong vấn đề chọn giống kháng bệnh tác giả chưa làm rõ được các tính trạng nghiên cứu có khả năng di truyền được cho thế hệ sau không. Đây cũng là hạn chế của đề tài [16].
Nghiên cứu đánh giá các xuất xứ Keo lá tràm bằng kĩ thuật DNA finger printing (Vuong, 2013) với các dòng Keo lá tràm được tiến hành tại vườn giống Fortip Ba Vì. Kết quả cho thấy tỉ lệ đa hình với các locus đạt 100%,
xuất xứ trong vườn giống có tính đa dạng di truyền với số allele trung bình là 10 allele/locus, tỉ lệ di hợp tử mong đợi He = 0,745 [51].
Trong một nghiên cứu năm 2013, Nguyễn Việt Cường và cộng sự đã sử dụng 14 chỉ thị SSR EMBRA để nghiên cứu khả năng sử dụng các chỉ thị này trong chọn lọc sớm các dòng bạch đàn lai. Đối tượng nghiên cứu là dòng lai UE24, UE27, UE3, UC2, UC80, CU91 đã được công nhận là giống quốc gia và giống tiến bộ kỹ thuật, UC78 là dòng sinh trưởng chậm ở ba địa điểm khảo nghiệm, các dòng UG54, UG38, UT64, CP4, UCM48 mới khảo nghiệm tại một địa điểm, các dòng kiểm chứng là E. urophylla thuần U6, PN14, PN47. Trong số 14 chỉ thị SSR thì 12 chỉ thị cho kết quả đa hình (trừ EMBRA70 và EMBRA87) và có sự khác biệt rõ rệt giữa các đối tượng. Kết quả bước đầu trong nghiên cứu này là các chỉ thị EMBRA28, EMBRA80, EMBRA93, EMBRA111, EMBRA187, EMBRA361 có thể sử dụng để phân biệt giữa các dòng sinh trưởng nhanh và chậm cho tổ hợp lai UE, UC, CU [5].
Một nghiên cứu khác của Đặng Thái Dương trên đối tượng Keo lá liềm, tác giả đã sử dụng 28 chỉ thị SSR nhưng chỉ 14 chỉ thị SSR cho kết quả tốt. Phân tích 14 chỉ thị này trên 53 đối tượng thu được 52 allele khác nhau, 19,23% allele đơn hình, 80,77% allele đa hình. Số allele/locus dao động từ 2 – 10, trung bình 3,71 allele/locus, hệ số tương đồng di truyền giữa các giống dao động từ 0,63 đến 0,98 với mức tương đồng di truyền 84%, từ đó đã chọn được 9 dòng ưu tú dựa vào chỉ thị phân tử phù hợp với 9 dòng ưu tú ở vườn ươm đã chọn có những đặc điểm về chỉ thị phân tử, chịu nóng, chịu hạn. Cũng trong nghiên cứu này, với 30 chỉ thị RAPD tác giả đã xác định được 14 chỉ thị cho kết quả đa hình với chất lượng tốt, thu được 2.928 băng ADN với 78 allele (41 allele đa hình, 37 allele đơn hình), trung bình có 209,14 băng/chỉ thị. Kích thước phân tử của allele nhỏ nhất là 250bp, allele lớn nhất 2.200bp. Đặc biệt, xuất hiện 9 allele ADN cá biệt
(chỉ xuất hiện duy nhất trên 1 mẫu nghiên cứu) và dựa vào các allele cá biệt này cùng với đánh giá kiểu hình tại lập địa tác giả đã đưa ra kết luận chỉ thị OPN5, OPN14, OPN16, OPO20, S256 có thể nhận biết 9 giống trong nghiên cứu có khả năng chống chịu hạn [7].
Các nghiên cứu về giống cây trồng lâm nghiệp trong nước và quốc tế đã có những thành công nhất định, với khả năng ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật sinh học phân tử trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau: đa dạng di truyền, phân tích tỷ lệ thụ phấn chéo, bảo tồn nguồn gene... nhưng hướng nghiên cứu chọn giống mang tính trạng năng suất, chất lượng mà các nhà khoa học mong muốn đang nhận được nhiều sự quan. Điều này buộc các nhà nghiên cứu phải xác định được mối quan hệ giữa chỉ thị phân tử với các tính trạng.
Chương 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu.
Xác định được khác biệt về di truyền ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm làm cơ sở cho chọn giống sớm.
2.2 Đối tượng và phạm vi, địa điểm nghiên cứu.
- 14 dòng bạch đàn thuộc 10 tổ hợp lai giữa E. urophylla và E. camaldulensis thuộc đề tài “Nghiên cứu lai giống một số loài bạch đàn, keo, tràm và thông” được chọn để nghiên cứu. Đây là các dòng đã khảo nghiệm hậu thế dòng vô tính tại hiện trường thuộc tỉnh Phú Thọ, Bình Dương, Bình Phước, Cà mau. Trong đó, 6 dòng được công nhận giống quốc gia và tiến bộ kỹ thuật tại các lập địa cụ thể.
- 70 chỉ thị phân tử SSR được chọn trong bộ 300 chỉ thị EMBRA đã công bố, theo bản đồ liên kết các chỉ thị này được phân bố trên 11 nhiễm sắc thể (phụ lục 1).
- Các nội dung nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được tiến hành tại Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp.
2.3 Nội dung nghiên cứu.
- Đánh giá sinh trưởng các giống bạch đàn lai được lựa chọn. - Xác định chỉ thị SSR đa hình.
- Phân tích sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh, sinh trưởng chậm bằng chỉ thị SSR đa hình.
- Phân tích sự khác biệt về di truyền giữa các tổ hợp và các giống bạch đàn lai bằng chỉ thị SSR đa hình
2.4 Phương pháp nghiên cứu.
2.4.1 Tách chiết ADN tổng số.
- Mẫu lá thu hái trên đối tượng nghiên cứu là mẫu lá sạch, hạn chế tối đa mẫu thu hái từ cây bị sâu bệnh. Mẫu thu hái không quá non và không quá già (lá bánh tẻ).
- Mẫu lá sau khi lấy về được bảo quản theo hai cách:
+ Cách 1: Bảo quản khô bằng silicagel (hạt hút ẩm) ở nhiệt độ thường. + Cách 2: Bảo quản lá tươi trong điều kiện nhiệt độ -20oC của tủ lạnh. - Tách chiết ADN tổng số từ lá bằng phương pháp cải tiến của Keb- Llanes và cộng sự (2002).
1. Cắt 0,3g lá thành từng phần thật nhỏ và loại bỏ gân lá.
2. Nghiền lá thành bột mịn trong cối chày sứ sạch với nitơ lỏng.
3. Bổ sung 300µl EBA, 900µl EBB (làm ấm ở 65oC) và 100µl SDS và nghiền nhẹ, sau đó cho vào ống 1,5ml
4. Ủ ấm ở 65oC trong 60 phút
5. Bổ sung 410µl potassium acetate lạnh, đảo đều, đặt trong đá 3 phút 6. Li tâm 13.200 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC
7. Hút 1ml dịch nổi sang ống 1,5ml mới, bổ sung 540µl isopropanol lạnh, đảo đều bằng tay và đặt trong đá 20 phút
8. Li tâm 10.200 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi
9. Bổ sung 500µl ethanol 70% và li tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút 10. Đổ bỏ dịch nổi, làm khô tủa ở nhiệt độ thường
11. Cho vào ống 300µl TE hòa tan rồi bổ sung 60µl sodium acetat 3M và