Kỹ thuật Real-Time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy được gọi là Real time; do đặc điểm này nên với Real-Time PCR người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc các sản phẩm khuếch đại đích. Vì vậy có thể nói Real-Time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thì nghiệm có thể thấy được. Kỹ thuật Real-Time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase của Taq DNA polymerase. Trong phản ứng Real- Time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ...) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ...). Kỹ thuật Real-Time PCR được ứng dụng rộng rãi trong phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh ở người như virus, vi khuẩn, nấm phục vụ cho chẩn đoán và theo dõi điều trị. Kỹ thuật Real-Time PCR với chất phát huỳnh quang SYBR Green phát hiện như; trong bệnh phẩm sử dụng một cặp mồi được thiết kế để nhân bản vùng gene IS6110. IS6110 là những trình tự gắn chèn đặc trưng cho các chủng vi khuẩn lao (Mycobacterium complex) và hiện diện với số lượng lớn trong DNA bộ gene của Mycobacterium và được xem là đối tượng thích hợp nhất để phát hiện vi khuẩn Lao. Mẫu xét nghiệm được kết luận là dương tính khi kết quả phân tích “đường cong nóng chảy” cho thấy Tm của sản phẩm PCR thu được tương ứng với Tm của vùng
gene IS6110 được nhân bản. Real-Time PCR còn được dùng trong nghiên cứu để phát hiện sốt rét cho việc đánh giá sốt rét tái phát hoặc tái nhiễm.
Tuy nhiên, kỹ thuật này chưa được áp dụng phổ biến vì giá thành cho mỗi xét nghiệm cao, thiết bị đắt tiền nên việc triển khai ở cộng đồng sẽ phức tạp hơn các kỹ thuật khác. Mặc khác, kỹ thuật này cũng có hạn chế là không phân biệt được tác nhân gây bệnh còn sống hay đã chết. Ngoài những nhược điểm của kỹ thuật này đã được nêu, kỹ thuật Real-Time PCR cũng có nhiều ưu điểm trong phát hiện KSTSR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và độ nhạy của kỹ thuật này cao gấp 1.000 lần so với kỹ thuật xét nghiệm KSTSR bằng lam máu soi kính hiển vi. Xác định từng loại KSTSR gây bệnh trên người là một khởi đầu quan trọng cho việc đề ra các biện pháp phòng chống dịch bệnh phù hợp. Đối với kỹ thuật xét nghiệm lam máu soi kính hiển vi không thể phát hiện, phân biệt đầy đủ và chính xác thành phần, cơ cấu KSTSR ở những trường hợp có mật độ nhiễm thấp, nhiễm phối hợp hai hay nhiều loài trong đó có một loài trội hẳn về số lượng. Hiện nay, có nhiều phương pháp và kỹ thuật phát hiện KSTSR trong đó kỹ thuật thường quy được sử dụng tại các cơ sở y tế hiện nay vẫn là xét nghiệm lam máu soi kính hiển vi được Tổ chức Y tế thế giới đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, đối với những người ở trong vùng SRLH nặng, người mang KSTSR mật độ thấp dưới ngưỡng phát hiện của kỹ thuật xét nghiệm lam máu soi kính hiển vi và test chản đoán nhanh nên nhiều đối tượng nhiễm KSTSR bị bỏ sót trong cộng đồng. Ứng dụng kỹ thuật Real- Time PCR có ý quan trọng trong giai đoạn phòng chống và loại trừ bệnh sốt rét. Đa số người dân sinh sống trong các vùng SRLH và những vùng SRLH cũ trước đây, đối tượng dân di biến động thường có miễn dịch với bệnh sốt rét nên khi nhiễm KSTSR ở mật độ thấp dưới ngưỡng phát hiện của kính hiển vi hoặc test chẩn đoán nhanh. Kỹ thuật Real-Time PCR có thể phát hiện ký sinh trùng sốt rét ở ngưỡng xấp xỉ 1 ký sinh trùng sốt rét/µl máu và có thể phân tích được 4 loài KSTSR gây bệnh trên người ở tất cả các mẫu thu thập được từ thực địa [98].
Một số nghiên cứu về phát hiện KSTSR bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu soi kính hiển vi, RDT và Real - Time PCR. Đánh giá hiệu quả chẩn đoán nhanh
KSTSR do P. falciparum bằng test Paracheck tại Ninh Thuận của Đạo Văn Huề và cộng sự (2004) cho thấy, tỷ lệ KSTSR được phát hiện bằng lam máu soi kính hiển vi chiếm 13,02%, trong đó KSTSR được phát hiện bằng test chẩn đoán nhanh chiếm 16,25%, tỷ lệ phát hiện KSTSR P. falciparum của hai kỹ thuật xét nghiệm khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05. Hiệu quả của test chẩn đoán nhanh trong phát hiện KSTSR do P. falciparum của nghiên cứu này có độ nhạy đạt 92,99%, độ đặc hiệu 95,44%, giá trị tiên đoán dương 75,68% và giá trị tiên đoán âm 98,89% [16]. Nghiên cứu về chẩn đoán và xác định KSTSR Plasmodium spp. bằng kỹ thuật Real- Time PCR của Mangold KA, Manson RU, Koay ES (2005). Kết quả cho thấy KSTSR được phát hiện ở ngưỡng khoản 0,01-0,02%. Nghiên cứu của Bùi Quang Phúc, Lê Đức Đào, Nguyễn Văn Tuấn (2006) Xác định cơ cấu KSTSR tại xã Thanh, huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị bằng kỹ thuật PCR. Cho thấy, trong số 152 mẫu máu nhiễm KSTSR được phát hiện bằng phương pháp lam máu soi kính hiển vi tỷ lệ nhiễm KSTSR P. falciprum chiếm 71,0%, KSTSR P. vivax chiếm 29,0% và tỷ lệ KSTSR P. falciprum được phát hiện bằng kỹ thuật PCR chiếm 65,80%, P. vivax
chiếm 16,40% và nhiễm phối hợp 17,80% [28], [87].