Theo các tài liệu đã công bố, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng axit shikimic như quang phổ so mầu, điện di mao quản, sắc ký lỏng hiệu năng cao… [36],[40],[42],[44]. Trong các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, rất nhiều tác giả đã sử dụng các loại cột khác nhau như trao đổi ion, cột silicagen dẫn xuất hoá NH2, cột C18…
Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên đã xây dựng phương pháp xác định hàm lượng axit shikimic bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột pha đảo C18, bao gồm 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn SPE (Solid Phase Extraction)
Dịch chiết tổng nếu đem bơm trực tiếp vào cột sắc ký lỏng sẽ cho ra các pic nhiễu trên sắc đồ, đồng thời giảm tuổi thọ của cột. Vì vậy, cần lọc mẫu, loại tạp chất trước khi bơm mẫu vào hệ thống sắc ký lỏng bằng cách cho mẫu đi qua cột chiết pha rắn C18 và sử dụng dung môi thích hợp để giải hấp trước khi bơm mẫu vào sắc ký lỏng.
Giai đoạn 2: Định lượng axit shikimic bằng phương pháp ngoại chuẩn trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Các điều kiện phân tích:
+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HP 1090 Serie II ( Hewlett Packart, Mỹ)
+ Cột pha đảo C18(ODS Hypersil, 5m, 125 x 4mm) + Detector mảng diot DAD
+ Pha động: dung dịch axit formic, tốc độ dòng 0,5ml/phút + Bơm mẫu:10l/lần.
1.4. Tổng kết những nghiên cứu về tinh dầu và axit shikimic trong quảHồi Hồi
Vì Hồi là loài cây đặc hữu nên các tài liệu nghiên cứu về Hồi ở trong và ngoài nước hiện nay rất ít, hầu hết các nghiên cứu trước đây mới chỉ đề cập đến đặc điểm sinh vật học, sinh thái học, kỹ thuật trồng... Các nghiên cứu về lĩnh vực chọn giống cây Hồi, đặc biệt chọn giống Hồi theo chỉ tiêu hàm lượng, chất lượng tinh dầu, hàm lượng axit shikimic còn rất ít.
Theo kết quả nghiên cứu năm 2004 của Nguyễn Huy Sơn và các cộng sự [24], hàm lượng tinh dầu trong quả Hồi dao động trong khoảng 5,12-9,72%, độ đông là 15-19°C và hàm lượng anethol trong tinh dầu là 89,1-98,57%. Từ các giá trị đó, tác giả đã chọn được 18 cây trội về sản lượng quả và hàm lượng, chất lượng tinh dầu để lấy vật liệu phục vụ nghiên cứu nhân giống vô tính. 18 cây trội này đồng thời có cả sản lượng quả cao vượt trội > 20%, hàm lượng tinh dầu 7%, độ đông 17°C và hàm lượng anethol 95%.
Năm 2006, Lưu Đàm Cư và các cộng sự [7] đã khẳng định hàm lượng tinh dầu trong quả Hồi biến đổi theo vụ thụ hoạch. Hàm lượng tinh dầu trong vụ mùa dao động trong khoảng 1,45-3,87%, trong vụ tứ quý là 1,9-4,98%. Tương ứng với hàm lượng trans-anethol dao động từ 70,05-95,96% ở vụ mùa và 83,35-99,2% ở vụ tứ quý, không có mẫu tinh dầu nào có hàm lượng cis- anethol cao quá 0,1%. Tác giả cũng chọn được một cây tốt nhất để làm giống có các chỉ tiêu hàm lượng và chất lượng tinh dầu là: Năng suất quả trung bình (3 năm liên tục) là 73,3kg; hàm lượng tinh dầu trong quả tươi là 2,7%, trong quả khô là 11,31%; hàm lượng trans-anethol trong vụ mùa là 95,96% và hàm lượng cis-anethol nhỏ hơn 0,1%.
Ngoài ra, tính biến động về hàm lượng và chất lượng tinh dầu còn được đề cập trong các nghiên cứu của Nguyễn Mê Linh, Nguyễn Văn Toàn... Năm 1977, Nguyễn Mê Linh xác định khoảng dao động của hàm lượng tinh dầu trong quả hồi tươi từ 1,2-2,61%, tương ứng với 7,69-12,24% trong quả khô. Năm 2005, nghiên cứu của Nguyễn Văn Toàn cho thấy hàm lượng tinh dầu trong quả khô tuyệt đối dao động trong khoảng rất lớn từ 4,37% (mẫu ở Cao Bằng) tới 17,49% (mẫu ở Lạng Sơn) (Dẫn từ [7])
Mới đây, hãng Roche đã hoàn thiện quy trình sản xuất thuốc Tamiflu - thuốc chống bệnh cúm gia cầm H5N1ở người mà nguyên liệu chủ yếu là axit shikimic được chiết tách từ quả Hồi của Trung Quốc. Trên Thế giới, quy trình tách chiết axit shikimic từ quả Hồi đã được Adam và các cộng sự [35] đề cập tới năm 1996, với phương pháp chiết Soxhlet và làm sạch bằng trao đổi anion và Solka-Foloc đã đạt hiệu suất lên tới 7%. Năm 2005, Payne Richard và Michael Edmonds [39] cũng đề xuất phương pháp chiết Soxhlet nhưng làm sạch bằng than hoạt tính.
Tại Việt Nam, các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu thành công quy trình chiết xuất axit shikimic từ hoa Hồi để tổng hợp hoạt chất oseltamivir. Viện Hoá học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là nơi đầu tiên chiết xuất thành công axit shikimic. Theo quy trình cứ 100kg quả hồi khô sẽ chiết xuất được 6,5–7 kg axit shikimic tinh khiết. Mẫu thu được qua kiểm tra trên máy phổ quang cộng hưởng từ cho thấy, độ tinh khiết của sản phẩm đạt 95%, có chất lượng tương đương với mẫu chuẩn của thế giới [16].
Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn tiếp tục hoàn thiện công nghệ để đạt mức tối ưu về chi phí, hiệu quả và chất lượng. Mục tiêu là chiết xuất được 9-10 kg axit shikimic từ 100 kg nguyên liệu [5], [9], [11], [13], [16], [26].
Tiếp sau đó, Viện Dược liệu (Bộ Y tế) cũng công bố là đơn vị thứ hai đã chiết xuất thành công axit shikimic trong quy mô phòng thí nghiệm. Với trang thiết bị hiện tại, Viện có khả năng chiết xuất và cung cấp khoảng 200-400 kg axit shikimic/ tháng, đủ để sản xuất hàng trăm nghìn viên Tamiflu cung cấp ra thị trường.
Tác giả Nguyễn Thị Luyện và các cộng sự [20] đã trình bày các nghiên cứu chiết tách axit shikimic từ quả Hồi bằng cách chiết trong bể điều nhiệt trong nước hoặc bằng cách đun hồi lưu trong cồn.
Nước ta có diện tích rừng Hồi rộng lớn. Tuy nhiên, để rừng Hồi đạt hiệu quả kinh doanh cao, trước tiên cần phải tuyển chọn nguồn giống Hồi chứa hàm lượng tinh dầu và hàm lượng axit shikimic cao với chất lượng tinh dầu
tốt. Do vậy, việc nghiên cứu đặc điểm về hàm lượng, chất lượng tinh dầu và hàm lượng axit shikimic trong quả Hồi là rất cần thiết, từ đó làm cơ sở cho chọn giống cây Hồi được chính xác.
Chương 2
Mục tiêu, nội dung, vật liệu, địa điểm và phương pháp nghiên cứu
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
-Tuyển chọn vùng chọn giống Hồi tốt nhất tại tỉnh Lạng Sơn theo chỉ tiêu hàm lượng, chất lượng tinh dầu.
- Đánh giá tính biến động và ổn định về hàm lượng, chất lượng tinh dầu và hàm lượng axit shikimic trong quả Hồi.
- Xác định được mối quan hệ giữa các chỉ tiêu: hàm lượng tinh dầu, chất lượng tinh dầu, hàm lượng axit shikimic và mối quan hệ giữa 3 chỉ tiêu trên với một số chỉ tiêu sinh trưởng và sản lượng quả.
- Đề xuất giải pháp chọn giống Hồi và tuyển chọn một số cây trội theo mục tiêu nâng cao lượng tinh dầu, chất lượng tinh dầu và lượng axit shikimic trên một cây.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Biến động về hàm lượng và chất lượng tinh dầu tại 3 vùng trồng Hồi Văn Quan, Bình Gia, Cao Lộc của tỉnh Lạng Sơn.
2.2.2. Mối quan hệ giữa hàm lượng tinh dầu, chất lượng tinh dầu và một số chỉ tiêu sinh trưởng tại Văn Quan.
2.2.3. Biến động về hàm lượng, chất lượng tinh dầu và hàm lượng axit shikimic của các cây trội về sản lượng quả.
2.2.4. Mối quan hệ giữa sản lượng quả, hàm lượng tinh dầu, chất lượng tinh dầu, hàm lượng axit shikimic và một số chỉ tiêu sinh trưởng của các cây trội về sản lượng quả.
2.2.5. Tính ổn định của hàm lượng tinh dầu, chất lượng tinh dầu trong quả qua một số năm theo dõi.
axit shikimic trong quả theo thời điểm thu hái.
2.2.7. Bước đầu đánh giá, tuyển chọn một số cây trội về lượng tinh dầu, chất lượng tinh dầu và lượng axit shikimic trên một cây.