1 42 ron nớ
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Đố t ợng nghiên cứu
Các chủng nấm mốc gây hỏng quả Cam được phân lập và định danh từ phòng Công nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Chế phẩm nanochitosan – tinh dầu nghệ 0,4% được cung cấp từ Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa Sinh Biển.
* Giống Cam Chín Sớm CS1: Được thu mua từ vườn tại Thị trấn Cao
Phong, huyện Cao Phong, tỉnh Hòa Bình.
* Đặ ểm của giống cam CS1:
- Thân cây có dạng thẳng đứng, gai ít và ngắn, góc phân cành lớn, tán cây hình trụ, đường kính tán rộng, tán đều, khả năng phân cành khoẻ.
- Cành cây sinh trưởng mạnh, lóng thưa, gai ít và ngắn, các đợt lộc sinh trưởng khoẻ. Trong đó lộc hè sinh trưởng khoẻ nhất. Góc phân cành lớn. Cành cấp 1: 50.9º, Cành cấp 2: 55.4º, Cành cấp 3: 61.6º, Cành cấp 4: 69.8º.
- Mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới màu xanh sáng. Dài lá: 8.59cm, rộng lá: 5.20cm, phiến lá hơi bầu biểu hiện ở chỉ số dài lá/ rộng lá (1.65), eo lá rất nhỏ (rộng: 0.09cm, dài :0.24cm ) eo lá thường xuất hiện trên cành hè hoặc cây con thời kỳ kiến thiết cơ bản.
- Chóp lá: Cam chín sớm có chóp lá hơi tù, đầu chóp lá có chia thùy nhỏ. - Hoa có màu trắng, có 5 cánh với nhiều bao phấn, hoa lưỡng tính mọc đơn hoặc thành chùm từ 5 - 7 hoa, hoa nở tập trung vào đầu đến giữa tháng 2 hàng năm.
- Quả Cam chín sớm khi chín có hình cầu, bề mặt vỏ quả nhẵn bóng, vỏ dầy, túi tinh dầu hơi to, khi chín vỏ quả có màu vàng cam, sáng và bóng, thịt quả màu vàng đậm rất hấp dẫn.
- Cam chín sớm có số lượng hạt trung bình/ quả khoảng 20,5 hạt, hạt đa phôi, số hạt lép chiếm tỷ lệ 6,82%.
- Thời gian thu hoạch quả: Cam CS1có thời gian thu hoạch quả trong khoảng 35 - 50 ngày tùy theo sản lượng và khả năng tiêu thụ sản phẩm, bắt đầu từ cuối tháng 9 đến trung tuần tháng 11.
2.1.2. Hóa chất sử dụng
Hóa chất: Các hóa chất dùng cho thí nghiệm đều đạt tiêu chuẩn phân tích.
Mô tr ờng: Môi trường nuôi cấy nấm mốc (Môi trường Crapek-Dox),
pH = 6,5. Môi
trường NaNO3 K2HPO4 MgSO4.7H2O KCl FeSO4 Saccarose Agar
g/l 3 1 0,5 0,5 0,01 20 16
2.1.3. Thi t bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
Tủ ấm (Friocell, Đức). Tủ lạnh (Toshiba).
Pipetman các loại (Gilson, Pháp). Máy khuấy từ (Roto Lab, OSI). Tủ cấy vô trùng (Sanyo).
Nồi khử trùng (Nhật Bản). Cân điện tử 10-2g
( Mettler Toledo).
Ngoài ra các thí nghiệm còn sử dụng một số dụng cụ thủy tinh, các trang thiết bị khác tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Viện hóa sinh
và Phòng thí nghiệm Tổng hợp và Chuyển giao Công Nghệ- Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Cây có múi.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Đ n oạt tính kháng nấm mốc của ch phẩm nano chitosan k t hợp với tinh dầu nghệ.
Chuẩn bị chế phẩm: Nanochitosan – tinh dầu nghệ 0,4%, Nanochitosan 0,4%, Chitosan 0,4%, Tinh dầu nghệ 0,4%, Kháng sinh miconazole cho nấm mốc.
Bƣớc 1: Hoạt hóa chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng.
Bƣớc 2: Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 3ml môi trường có bổ sung chế phẩm ở các dải nồng độ khác nhau. Đối chứng là ống nghiệm chỉ có môi trường nuôi cấy, không bổ sung chế phẩm. Bổ sung nấm mốc kiểm định đến nồng độ cuối cùng 104 - 105 CFU/ml.
Bƣớc 3: Nuôi ở điều kiện nhiệt độ thích hợp trong khoảng thời gian xác định ở 28ºC trong 72h, đánh giá bằng mắt thường sự sinh trưởng của các chủng vi sinh.
Bƣớc 4: Đổ đĩa thạch môi trường Czapek – Dok.
Bƣớc 5: Lấy 100μl canh trường nuôi từ các ống thí nghiệm ở trên (gồm ống đối chứng và ống có chế phẩm mà không phát hiện sự sinh trưởng của nấm), cấy trải lên đĩa thạch chuẩn bị ở trên. Để khô, lật ngược đĩa và nuôi ở nhiệt độ thích hợp. Xác định sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường đặc sau 48h-72h.
MIC được đọc sau 72h tương đương với nồng độ trong ống không nhìn thấy sự phát triển của nấm mốc. Nồng độ thấp nhất của các chế phẩm NC – TDN, NC, CS, TD, kháng sinh ức chế sinh trưởng của vi sinh vật được tính là MIC.
MFC được xác định bằng cách cấy trải 100 µl dịch nuôi cấy từ các ống thí nghiệm MIC mà không nhìn thấy sự phát triển của nấm mốc lên môi trường thạch, nuôi ở điều kiện thích hợp. MFC là nồng độ ở ống không có
sinh tưởng của nấm (không có nấm phát triển trên môi trường đặc).Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần cho mỗi chủng nấm.
Phần trăm ức chế được tính theo công thức:
% ức chế = (A0 – As)/A0 * 100%. Trong đó A0 là số khuẩn lạc mọc trên đĩa đối chứng (CFU/ml), As là số khuẩn lạc mọc trên đĩa thí nghiệm (CFU/ml).
2.2.2. Nghiên cứu sử dụng ch phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ ể xử lý C m tr ớc thu hoạch.
* Th nghiệm gồm 5 công thức:
CT1 : Không phun
CT2 : Phun chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ 1 lần (tháng 7) CT3 : Phun chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ 2 lần (tháng 8) CT3 : Phun chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ 3 lần (tháng 9) CT5 : Phun chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ 4 lần (tháng 10)
* Các công thức của mỗi thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần.
* Chỉ tiêu theo d i:
- Tình hình sinh trưởng phát triển của cây Cam Chín sớm CS1 trước và sau khi phun chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ.
- Sinh trưởng phát triển của cây: Đường kính tán (cm), đường kính thân (cm). - Một số chỉ tiêu về năng suất, chất lượng: khối lượng trung bình quả (g), số quả trung bình/cây (quả), năng suất trung bình/cây (kg/cây).
- Chất lượng quả Cam Chín sớm CS1 sau khi phun chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ được phân tích đánh giá bằng cảm quan và các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá đặc trưng của giống Cam Chín Sớm CS1. Các chỉ tiêu cảm quan (trạng thái, mùi vị, màu sắc) dựa theo thang Hedonic, các chỉ tiêu
sinh lý, sinh hoá được phân tích bằng các phương pháp phân tích thông dụng, 7 ngày phân tích 1 lần.
- Lấy mẫu quả để phân tích: Mỗi công thức lấy ngẫu nhiên 30 quả (mỗi lần nhắc lấy 10 quả).
+ Hàm lượng chất khô hòa tan tổng số (%): được xác định theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5366-91.
+ Hàm lượng đường tổng số (%): được xác định theo TCVN 4594-88. + Hàm lượng vitamin C (mg%): được xác định theo tiêu chuẩn TCVN 6424-2:1998.
+ Axit tổng số %: được xác định theo phương pháp chuẩn độ NaOH 0,1N tiêu chuẩn TCVN 5483-2006.
+ Độ Brix %: được đo bằng Brix kế cầm tay (số liệu trung bình của 30 quả).
+ Tỷ lệ xơ bã %: được xác định theo tiêu chuẩn TCVN 5714:2007. + Độ chắc mm: được xác định theo tiêu chuẩn TCVN 1578:2007.
- Các chỉ tiêu phẩm chất quả Cam Chín Sớm CS1 ở các công thức: Hàm lượng chất khô (%), Đường tổng số (%), VTM C (mg/100g), Acid tổng số (%), Brix (%), Tỷ lệ xơ bã (%).
- Tình hình sâu bệnh hại trên quả Cam Chín sớm CS1 ở các công thức thí nghiệm.
2.2.3. Nghiên cứu sử dụng ch phẩm nanochitosan - tinh dầu nghệ trong quá trình bảo quản cam sau khi thu hoạch.
* Th nghiệm gồm 7 công thức
CT1 : Không phun, không nhúng
chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ
CT3 : Phun chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ 2 lần + nhúng chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ
CT4 : Phun chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ 3 lần + nhúng chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ
CT5 : Phun chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ 4 lần + nhúng chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ
CT6 : Nhúng chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ 1 lần CT7 : Nhúng chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ 2 lần
* Các công thức của mỗi thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần.
* Chất lượng quả trước, trong quá trình và sau bảo quản được phân tích đánh giá bằng cảm quan và các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá đặc trưng của giống Cam Chín Sớm CS1.
- Các chỉ tiêu cảm quan (màu sắc, trạng thái tự nhiên của quả, mùi vị) được đánh giá thông qua hội đồng đánh giá thị hiếu (Hedonic scale) bằng cách cho điểm từ 1-9 (có thể cho điểm lẻ), trong đó điểm 9 tương đương với mức cao nhất (Extremely like), điểm 1 tương đương với mức thấp nhất (Extremely dislike) và điểm 5 tương đương với mức trung bình (Neither like nor dislike).
Thời gian đánh giá: Sau khi bảo quản quả Cam Chín sớm CS1 7, 14, 21, 28 ngày.
- Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá được phân tích bằng các phương pháp phân tích thông dụng, 7 ngày phân tích 1 lần.
Các chỉ tiêu phân tích:
a. Phân tích chất l ợng quả tr ớ k bảo quản, gồm các chỉ tiêu:
- Kích thước, khối lượng - Màu sắc
- Hàm lượng chất khô hòa tan tổng số. - Hàm lượng nước
- Hàm lượng đường tổng số - Hàm lượng acid
- Tỷ lệ thu hồi
- Tỷ số hàm lượng đường/acid
b P ân tí n ất l ợng quả trong và sau khi bảo quản, gồm các chỉ tiêu:
* Chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa:
- Hàm lượng chất khô hòa tan tổng số - Hàm lượng nước
- Hàm lượng đường tổng số - Hàm lượng axít
- Xác định tỷ lệ hư hỏng trong quá trình bảo quản
Địa điểm nghiên cứu: Mẫu quả thu từ các hộ trồng Cam Chín Sớm CS1 tại thị trấn Cao Phong, huyện Cao Phong, tỉnh Hòa Bình; các thí nghiệm bảo quản được thực hiện tại phòng Thí nghiệm Tổng hợp và Chuyển giao Công nghệ, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Cây có múi.
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá khả năng đối kháng nấm mốc gây hỏng quả của chế phẩm nano chitosan với tinh dầu nghệ in vitro.
Chế phẩm nanochitosan - tinh dầu nghệ sử dụng có kích thước hạt khoảng 50nm, và thế zeta là 35,4 ± 6,18 mV. Các giá trị này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả kháng nấm của chế phẩm.
Để đánh giá hiệu quả kháng nấm của chế phẩm, tiến hành đánh giá khả năng kháng nấm của nano chitosan – tinh dầu nghệ so với kháng sinh và các chế phẩm NC, CS, TD thông qua giá trị MIC, MFC. Sử dụng kháng sinh miconazole đối với chủng nấm mốc gây hỏng quả là Fusarrium oxysporum,
Aspergillus awamori và Penicillium italicum.
Dung dịch CS 0,4% được chuẩn bị bằng cách hòa tan chitosan trong acid acetic 1%. Dung dịch TD 0,4% được chuẩn bị bằng cách hòa tan tinh dầu gốc trong ethylene glycol lỏng hoặc trong ethanol.Tinh dầu củ nghệ vàng của Việt Nam có thành phần chính là ar-turmerone (30,3%), α-zingiberene (3,44%), β-caryophyllene (3,02%), β-sesquiphellandrene (4,42%) và ar- curcumene (3,02%).
Hiệu quả kháng nấm mốc của các chế phẩm được đánh giá thông qua giá trị MIC và MFC (bảng 3.1).Giá trị MIC và MFC càng nhỏ chứng tỏ khả năng kháng nấm mốc của chế phẩm càng tốt.
Bảng 3.1: Khả năng kháng nấm của các chế phẩm Chủng thử
nghiệm
Nồng độ chế phẩm (µg/ml)
Kháng sinh NC – TDN NC CS TD
MIC MFC MIC MFC MIC MFC MIC MFC MIC MFC
Fusarium oxysporum 25 50 6,5 62,5 15,625 62,5 15,625 125 1250 2500 Aspergillus awa-mori 10 40 500 2000 500 2000 2000 3000 500 2000 Penicillium italicum 20 40 100 200 100 400 100 400 100 400
Kết quả bảng trên cho thấy sự mẫn cảm với chế phẩm của nấm
Fusarium oxysporum thử nghiệm, hoạt tính kháng nấm của NC –TDN cao hơn so với chế phẩm khác với giá trị MIC 6,5µg/ml, trong khi giá trị MIC của các chế phẩm NC và CS có giá trị là 15,625µg/ml, giá trị MFC của chế phẩm CS là 125µg/ml cao gấp đôi MFC hai chế phẩm NC- TDN và NC, điều này cho thấy khả năng kháng nấm của chế phẩm NC – TDN và NC cao hơn hẳn so với dung dịch CS. Loại nấm này cần một liều lượng TD lớn mới có thể diệt hoàn toàn sự phát triển với giá trị MFC là 2500µg/ml. Khả năng ức chế nấm của chế phẩm NC – TDN cao hơn so với kháng sinh thử nghiệm là Miconazole, giá trị MIC của kháng sinh Miconazole là 25µg/ml cao hơn gấp hơn 3 lần giá trị MIC của NC- TDN.
Ngược lại với chủng Fusarium oxysporum, hoạt tính ức chế sinh trưởng
Aspergillus awamori của các chế phẩm không đáng kể vì cần liều lượng chế phẩm rất cao mới có thể ức chế và tiêu diệt được chủng thử nghiệm. Cụ thể, nồng độ ức chế tối thiểu của các chế phẩm NC – TDN, NC, TDN có giá trị MIC = 500µg/ml, khả năng diệt nấm tối thiểu MFC là 2000µg/ml. Nấm
tiêu diệt hoàn toàn sự phát triển của chúng. Theo một số tác giả, sở dĩ các chủng nấm thuộc chi Aspergillus có tính đối kháng đối với nano chitosan mạnh hơn bởi chitosan là một trong các hợp phần của thành tế bào của chúng (10% chitosan trong thành tế bào Aspergillus).
Đối với chủng Penicillium italicum, mặc dù hoạt tính kháng nấm của các chế phẩm sử dụng không bằng được kháng sinh miconazole (có MIC là 20 µg/ml và MFC là 40 µg/ml) tuy nhiên cũng đã thu được những kết quả nhất định. Giá trị MIC ở tất cả các chế phẩm thu được đều như nhau là 100 µg/ml, nhưng khả năng kháng nấm của NC - TDN vẫn tốt hơn so với các chế phẩm còn lại vì chỉ cần 200 µg/ml chế phẩm NC - TDN đã có thể tiêu diệt hoàn toàn nấm mốc phát triển trong khi các chế phẩm NC, CS, TDN phải sử dụng liều lượng gấp đôi mới có thể ngăn chặn sự phát triển của loại nấm này. Hơn nữa Penicillium italicum là loại nấm mốc đặc trưng gây bệnh cho cam nên việc đánh giá được hiệu quả của chế phẩm nanochitosan tinh dầu nghệ đối với loại nấm này có ý nghĩa rất lớn trong việc sử dụng chế phẩm để xử lý và bảo quản cam trước và sau khi thu hoạch.
Tóm lại qua kết quả ở bảng 3.1 cho thấy hiệu quả kháng nấm của nanochitosan - tinh dầu nghệ cao hơn so với nano chitosan, chitosan và tinh dầu. Điều này có thể giải thích là do các hạt nanchitosan có kích thước rất nhỏ nên có diện tích bề mặt lớn và có thể hút bám chặt lên bề mặt tế bào nấm, phá vỡ tính toàn vẹn của màng tế bào vì thế khả năng đối kháng tăng lên đáng kể. Kích thước hạt nano giữ vai trò quan trọng trong việc xác định hoạt tính đối kháng vi sinh vật của các hạt nano bởi chúng đi vào trong tế bào thông qua các protein vận chuyển hoặc kênh ion. Vì vậy, hạt nhỏ hơn sẽ dễ dàng đi vào trong tế bào hơn. Điện tích bề mặt của các hạt có vai trò trong hiệu quả ức chế sinh trưởng của nấm là do điện tích dương của chúng cải thiện tương tác giữa hạt nano chitosan và bề mặt tế bào vi sinh vật tích điện âm. Kết quả làm cho
thành tế bào của nấm bị thay đổi và cuối cùng các chất trong tế bào bị rỉ ra ngoài và dẫn tới tế bào bị chết. Hơn nữa tinh dầu nghệ từ lâu được biết đến là chất có khả năng kháng vi sinh vật rất tốt nên việc kết hợp chitosan và tinh dầu nghệ có thể nâng cao hiệu quả kháng nấm của chế phẩm nanochitosan - tinh dầu nghệ.
Hầu như chưa có nghiên cứu nào tiến hành bọc tinh dầu nghệ bằng nano chitosan và nghiên cứu hoạt tính đối kháng vi sinh vật của chúng. Chỉ có một vài nghiên cứu bọc một số loại tinh dầu thực vật bằng nano chitosan hoặc các hạt nano lipid và đánh giá các đặc tính lý học của chúng. Haroldo và cộng sự (2010) chứng minh khả năng diệt ấu trùng Aedes aegypti của các hạt nano angico- chitosan mang tinh dầu Lippia sidoides và cho rằng đây là một công cụ triển vọng để kiểm soát bệnh sốt xuất huyết [28]. Terpences được bao gói trong nhũ tương nano lecitin có giá trị MIC và MBC thấp hơn so với hỗn hợp terpenes khi thử nghiệm lên E.coli, L. delbrueckii và S.cevevisiae in vitro.Terpenes nanocapsules cũng cho thấy khả năng bất hoạt hoàn toàn