a. Phương pháp thực hiện:
Hòa tan 0.400g Glibenclamide trong 100ml C2H5OH (gọi là dung dịch R) ở nhiệt độ 40-500C. Thêm vài giọt phenolphthalein vào dung dịch R làm chất hiển thị. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1M cho đến khi màu đỏ xuất hiện.
1ml NaOH 0.1M tương ứng với 49.40mg của Glibenclamide
b. Chuẩnbị mẫu phân tích:
Áp dụng công thức: % 100 10 40 . 49 3 P V HL P1 = 0.4092 P4 = 0.4052 P7 = 0.4021 P2 = 0.4003 P5 = 0.4013 P8 = 0.4030 P3 = 0.4005 P6 = 0.4007 P9 = 0.4015
c. Kết quả trung bình sau khi phân tích.
HL = 99.95%
Như vậy sản phẩm glibenclamide đạt hàm lượng theo tiêu chuẩn dược điển
1. Định lượng:
Phương pháp chuẩn độ: 99,95%
2. Xác định cấu trúc glibenclamide bằng các phương pháp phổ + HPLC: đạt
+ ESI-MS: 494/496 [M+H]+
+ 1H, 13C NMR: Phù hợp với cấu trúc sản phẩm glibenclamide IV.2.4. Thẩm định tiêu chuẩn sản phẩm glibenclamide
1 Sản phẩm glibenclamide: + Hợp chất rắn màu trắng trong + mp: 169-1710C
+ UV-VIS: max: 300nm; min: 275nm + Độ ẩm: 0,058% + Tro sulfat: 0,05% + Kim loại nặng: 0 3. Định lượng: Phương pháp chuẩn độ: 99,95% HL1 = 100.1 HL4 = 100.05 HL7 = 100.02 HL2 = 99.8 HL5 = 100 HL8 = 100.03 HL3 = 99.8 HL6 = 99.8 HL9 = 100
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích và xác định cấu trúc của Glibenclamide và các sản phẩm trung gian đã tổng hợp được
Quy trình tổng hợp glibenclamide đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới [12-24]. Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp glibenclamide phù hợp với điều kiện Việt Nam. Quy trình tổng hợp glibenclamide được thực hiện qua 3 bước phản ứng như trong sơ đồ 3.1. Đầu tiên, tiến hành phản ứng clo hóa của hợp chất axit 5-chloro-2- methoxybenzoic (1) bằng tác nhân SOCl2 nhận được hợp chất 5-chloro-2- methoxybenzoyl chloride (2). Tiếp theo, thực hiện phản ứng amit hóa với amin 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonamide (3) trong pyridin nhận được hợp chất 5-chloro-2-methoxy-N-(4-sulfamoylphenethyl)benzamide (4). Cuối cùng phản ứng của hợp chất 4 với cyclohexyl isocyanat thu được sản phẩm Glibenclamide với hiệu suất tổng là 63%.
Các phản ứng trên được thực hiện trong điều kiện phản ứng êm dịu, phù hợp với điều kiện ở Việt Nam. Từ quy trình này có thể sử dụng để nghiên cứu tổng hợp Glibenclamide lượng lớn, ở quy mô sản xuất công nghiệp.
Cl O OH OMe 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride 5-chloro-2-methoxy-N-(4-sulfamoylphenethyl) benzamide Cl O Cl OMe glibenclamide N=C=O NH2 S O O NH2 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonamide SOCl2 axit 5-chloro-2-methoxybenzoic CH2Cl2, 25oC, 8h Axeton, Na2CO3 25oC, 36h pyridin, 60oC,8h (3) 1 2 (86%) 4(90%) 5 (82%) O Cl O N H S O O NH2 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 5 6 4 3 2 1 O Cl O N H S O O H N 16 15 14 13 12 11 109 8 7 5 6 4 3 2 1 H N O
Sơ đồ 3.1. Tổng hợp chung về glibenclamide.
3.1.1. Tổng hợp 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride. Cl Cl O OH OMe 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride Cl O Cl OMe SOCl2 axit 5-chloro-2-methoxybenzoic CH2Cl2, 25oC, 8h 1 2 (86%)
Sơ đồ 3.1.1. Tổng hợp 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride (2)
5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride (2) được tổng hợp bằng phản ứng clo hóa với tác nhân SOCl2 đi từ axit 5-chloro-2- methoxybenzoic (1). Phản ứng được thực hiện trong dung môi diclometan tại nhiệt độ 0oC, thời gian phản ứng trong 8h nhận được sản phẩm 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride
(2) với hiệu suất 86%. Sản phẩm được sử dụng cho bước tiếp theo, không cần tinh chế thêm.
3.1.2. Phân tích và xác định cấu trúc của hợp chất trung gian 5-chloro-2-
5-chloro-2-methoxy-N-(4-sulfamoylphenethyl) benzamide Cl O Cl OMe NH2 S O O NH2 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonamide pyridin, 60oC,8h (3) 2 (86%) 4(90%) O Cl O N H S O O NH2 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 5 6 4 3 2 1 +
Sơ đồ 3.1.2. Tổng hợp hợp chất trung gian 4
Hợp chất trung gian 5-chloro-2-methoxy-N-(4
sulfamoylphenethyl)benzamide (4) được thực hiện phản ứng ngưng tụ giữa 1 mol đương lượng chất 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride (2) với 1 mol đương lượng của 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonamide (3) trong môi trường pyridin ở nhiệt độ 600C trong khoảng 8h tạo thành hợp chất 4 với hiệu suất phản ứng đạt 90% sau khi được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải Hexan:EtOAc (6:4).
Cấu trúc của hợp chất trung gian 4 được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13C-NMR và phổ khối lượng EI-MS.
Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của chất trung gian (4).
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 4 xuất hiện đầy đủ các tín hiệu đặc trưng cho độ chuyển dịch hóa học của các proton có mặt trong phân tử. Tín hiệu ở δH 8,25 ppm (1H, m,) đặc trưng cho proton nhóm NH, tín hiệu δH 7,28 ppm (2H, bs,) đặc trưng cho proton nhóm NH2, tín hiêu δH 3,81ppm (3H, s, OMe) đặc trưng cho proton nhóm OMe. Trong phổ 1H- NMR của chất này còn xuất hiện các tín hiệu của 7 proton vòng thơm của H- 2, H-6, H-11, H-13, H-3, H-5 và H-14 lần lượt tại các vị trí δH (ppm) 7,76 (2H, d, J=8,5Hz, H-2 và H-6); 7,64 (1H, d, J=3Hz, H-11); 7,51-7,48 (1H, dd, J=3Hz và 9Hz, H-13); 7,45 (2H, d, J=8,5Hz, H-3 và 5); 7,16 (1H, d, J=9Hz, H-14). Tín hiệu của hai nhóm metylen CH2-7 và CH2-8 tại các vị trí δH (ppm) 3,55-3,51 (2H, m, H-8); 2,93-2,90 (2H, m, H-7).
Hình 3.2: Phổ 13C-NMR của chất trung gian (4)
Phổ 13C-NMR của chất trung gian 4 khẳng định sự có mặt của 16 nguyên tử cacbon bao gồm nhóm cacbonyl CO tại vị trí δC (ppm) 163,56 (C-9). Tín hiệu của 12 nguyên tử cacbon vòng thơm tại các vị trí δC (ppm) 155,65 (C- 15); 143,58 (C-4); 142,09 (C-1); 131,45 (C-13); 129,45 (C-11); 129,12(C-3 và 5); 125,65 (C-2 và 6); 124,79 (C-12); 124,29 (C-10) và 114,13 (C-14). Ngoài ra trên phổ 13C-NMR của chất trung gian 4 xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm metoxi tại δC56,23 (OMe); 2 nhóm metylen (CH2) tại δC 54,83 (C-8) và 34,55 (C-7).
* Phổ khối lượng của hợp chất 4
Phổ khối lượng EI-MS cho pic ion giả phân tử 4 ở m/z 368 [M +H]+ (C16H17ClN2O4S ).
Từ các kết quả phân tích của phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H- NMR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13C-NMR và phổ khối lượng EI-
MS của hợp chất 4 khẳng định cấu trúc của hợp chất trung gian 5-chloro-2- methoxy-N-(4 sulfamoylphenethyl)benzamide (4) 3.1.3. Tổng hợp glibenclamide. glibenclamide Axeton, Na2CO3 25oC, 36h 4 5 (82%) O Cl O N H S O O NH2 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 O Cl O N H S O O H N 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 H N O N C O + Sơ đồ 3.1.3. Tổng hợp glibenclamide
Cuối cùng sản phẩm glibenclamide được tạo thành từ hợp chất trung gian 5-chloro-2-methoxy-N-(4 sulfamoylphenethyl)benzamide (4) (1 mol đương lượng) và cyclohexyl isocyanat (1 mol đương lượng) trong môi trường kiềm Na2CO3 dung môi aceton. Phản ứng được thực hiện tại nhiệt độ phòng trong khoảng 36h tạo thành hợp chất glibenclamit 5 với hiệu suất đạt được 82%. ( Sơ đồ 3.1).
Như vậy, sản phẩm glibenclamide đã được nghiên cứu tổng hợp qua ba bước phản ứng từ axit 5-chloro-2-methoxybenzoic. Tất cả các bước phản ứng đều đạt hiệu suất cao. Hiệu suất tổng cho quá trình tổng hợp glibenclamide đạt khoảng 63%.
3.2. Phân tích cấu trúc và hàm lượng của glibenclamide bằng các phương pháp hóa lý hiện đại pháp hóa lý hiện đại
3.2.1. Phân tích cấu trúc của glibenclamide bằng phương pháp phổ cộng
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của chất glibenclamide 5.
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của sản phẩm glibenclamide
5 xuất hiện đầy đủ các tín hiệu đặc trưng cho độ chuyển dịch hóa học của các proton có mặt trong phân tử. Tín hiệu của 7 proton vòng thơm H-2, H-6, H- 11, H-3, H-5, H-13 và H-14 lần lượt tại các vị trí δH (ppm) 7,93 (2H, d, J=8,5Hz, H-2 và H-6); 7,83 (1H, d, J=2,5Hz, H-11); 7,52 (2H, d, J=8,5Hz, H- 3 và H-5); 7,47 (1H, dd, J=9 và 2,5Hz, H-13); 7,11 (1H, d, J=9Hz, H-14). Ngoài ra trên phổ 1H-NMR của sản phẩm glibenclamide 5 còn xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của nhóm metoxi và hai nhóm metylen cộng hưởng lần lượt
O Cl O N H S O O H N 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 5 6 4 3 2 1 H N O
tại các vị trí δH (ppm) 3,85 (3H, s, OMe); 3,72 (2H, t, J=14Hz, H-8) và 3,05(2H, t, J=7Hz, H-7). Tín hiệu của 11 proton vòng no cộng hưởng tại các vị trí δH (ppm) 3,43-3,42 (1H, m); 1,78-1,17 (10H, m).
3.2.2. Phân tích cấu trúc của glibenclamide bằng phương pháp phổ cộng
hưởng từ hạt nhân cacbon 13C-NMR
Hình 3.4: : Phổ 13C-NMR của chất glibencalmide (5) .
Phổ 13C -NMR của glibenclamide khẳng định sự có mặt của 23 nguyên tử cacbon bao gồm 2 nhóm cacbonyl CO tại các vị trí δC (ppm) 166,6 (NHCONH) và 159,9 (NHCO). Tín hiệu của 12 nguyên tử cacbon vòng thơm tại các vị trí δC (ppm) 157,7 (C-15); 144,1 (C-4); 133,4 (C-1); 131,5 (C-13); 129,9 (C-3 và C-5); 128,1 (C-2, C-6 và C-11); 127,1 (C-12); 124,8 (C-10) và 114,8 (C-14). Ngoài ra trên phổ 13C-NMR của sản phẩm glibenclamide 5 còn xuất hiện các tín hiệu cacbon no của nhóm metoxi và hai nhóm metylen lần
O Cl O N H S O O H N 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 5 6 4 3 2 1 H N O
lượt tại các vị trí δC (ppm) 357,1 (OCH3); 41,8 (C-7); 36,0 (C-8). Tín hiệu của 6 cacbon vòng no tại các vị trí δC (ppm) 49,7; 34,7; 26,7; 26,7; 26 và 25,9.
3.2.3. Phân tích cấu trúc của glibenclamide bằng phương pháp phổ khối lượng lượng
Phổ khối lượng EI-MS cho pic ion giả phân tử glibenclamide ở m/z 495 [M +H]+ (C23H28ClN3O5S).
Hình 3.5: Phổ EI-MS của glibenclamide (5).
3.2.4.Phân tích hàm lượng sản phẩm glibenclamide(4) bằng phương pháp chuẩn độ
Hàm lượng của glibenclamide được xác định bằng phương pháp chuẩn độ với kết quả thực hiện đối với mẫu phân tích đạt 99,95%.
*Phương pháp thực hiện:
Hòa tan 0.400g Glibenclamide trong 100ml C2H5OH (gọi là dung dịch R) ở nhiệt độ 40-500C. Thêm vài giọt phenolphthalein vào dung dịch R làm chất hiển thị. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1M cho đến khi màu đỏ xuất hiện.
1ml NaOH 0.1M tương ứng với 49.40mg của Glibenclamide
*Chuẩnbị mẫu phân tích:
Áp dụng công thức: % 100 10 40 . 49 3 P V HL
*Kết quả trung bình sau khi phân tích.
HL = 99.95%
Như vậy sản phẩm glibenclamide đạt hàm lượng theo tiêu chuẩn dược điển
3.2.5. Phân tích một số chỉ tiêu hóa lý khác của sản phẩm glibenclamide.
a) Một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm glibenclamide: + Hợp chất rắn màu trằng trong. P1 = 0.4092 P4 = 0.4052 P7 = 0.4021 P2 = 0.4003 P5 = 0.4013 P8 = 0.4030 P3 = 0.4005 P6 = 0.4007 P9 = 0.4015 HL1 = 100.1 HL4 = 100.05 HL7 = 100.02 HL2 = 99.8 HL5 = 100 HL8 = 100.03 HL3 = 99.8 HL6 = 99.8 HL9 = 100
+ Nhiệt độ nóng chảy (mp): 169-171oC.
+ Độ hấp thụ quang UV-VIS: max : 300nm ; min: 275nm
+ Rf : 0,4 ( CH2Cl2/MeOH, 9/1), 25TLC aluminium sheets 20 X 20 cm Silicagel 60 F254 ( MERCK)
Độ ẩm : 0,059%.
b) Hàm lượng các kim loại nặng
Hàm lượng kim loại nặng được xác định tại phòng Kỹ thuật phân tích, trên thiết bị Quang phổ hấp thụ nguyên tử Perkin- Elmer AAS-3300. Hàm lượng các kim loại nặng như: Pb, Cd < 1ppm.
c) Độ sạch của glibenclamide được xác định theo phương pháp LC-MS Sản phẩm đạt độ sạch 99,23%.
d) Hàm lượng glibenclamide được xác định theo phương pháp chuẩn độ đạt độ sạch: 99,95%
KẾT LUẬN
Luận văn đã hoàn thành được các mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
1. Đã phân tích, xác định cấu trúc và hàm lượng của glibenclamide tổng hợp được bằng các phương pháp hóa lý hiện đại:
- Bằng phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C - NMR, phổ hồng ngoại IR đã khẳng định cấu trúc của sản phẩm glibenclamide tổng hợp được.
- Đã sử dụng phương pháp khối phổ (MS) để xác định số khối glibenclamide. Khối phổ của glibenclamide cho pic ion giả phân tử tại m/z 495 [M +H]+ (C23H28ClN3O5S).
- Đã phân tích hàm lượng của glibenclamide bằng phương pháp chuẩn độ và kết quả xác định được hàm lượng của glibenclamide đạt 99,23%. - Đã tiến hành phân tích một số chỉ tiêu hóa lý khác của glibenclamide
như độ ẩm, hàm lượng kim loại nặng, UV-VIS, điểm chảy, Rf,
2. Đã phân tích và khẳng định cấu trúc của các sản phẩm trung gian 5- chloro-2-methoxy-N-(4-sulfamoylphenethyl)benzamide bằng các phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C –NMR và phổ khối lượng.
3. Luận văn đã tổng hợp được glibenclamide và sản phẩm trung gian qua ba bước phản ứng, cả 3 bước phản ứng cho hiệu suất cao từ 82-90%. Hiệu suất chung cho cả quá trình tổng hợp glibenclamide là 63%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Tạ Văn Bình, Hoàng Kim Ước và cộng sự (2004),"Dịch tễ học bệnh đái tháo đường, các yếu tố nguy cơ và các vấn đề liên quan đến quản lý bệnh đái tháo đường tại khu vực nội thành 4 thành phố lớn năm 2001", Một số công trình nghiên cứu khoa học tiêu biểu của các dự án quốc gia thực hiện tại bệnh viện nội tiết 1969-2003,NXB Y Học,tr.173-199.
2. Tạ Văn Bình, Hoàng Kim Ước và cộng sự (2004), "Kết quả điều tra đái tháo đường và rối loạn dung nạp đường huyết ở đối tượng có nguy cơ cao tại Phú Thọ, Sơn La, Thanh Hoá và Nam Định năm 2003"- Một số công trình nghiên cứu khoa học tiêu biểu của các dự án quốc gia thực hiện tại bệnh viện nội tiết 1969-2003, NXB Y Học,tr. 353-373.
3. Tạ Văn Bình, Stephen Colargiuri và cộng sự (2004), Phòng và quản lý bệnh đái tháo đường tại Việt Nam-Phần 2, NXB Y Học,tr. 8-9, 12-13,17
5.Trương Phương và Ngô Quốc Huy (2006), “ Tạp chí Dược học ’’,tr. 264, 11-13.
6.Thái Hồng Quang (1997), “Bệnh đái tháo đường, Bệnh nội tiết ’’, NXB Y Học,Hà Nội, tr. 257-358.
7. Lê Đình Sáng (2010),Y học cổ truyên,NXB Y Học,Hà Nội.
8. Mai Thế Trạch và cộng sự ( 1994),"Dịch tễ học và điều tra cơ bản về bệnh tiểu đường ở nội thành thành phố Hồ Chí Minh". Tạp chí Y Học, chuyên đề nội tiết học, Trường Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh,tr. 25-28.
9.Nguyễn Đình Triệu (2006), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
10.Nguyễn Đình Thành (2011),Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng trong hoá học, NXB Khoa học kỹ thuật,Hà Nội.
11. Nguyễn Minh Thảo (2001), Tổng hợp hữu cơ, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội.
Tiếng Anh.
12.Ashcroft SJH, Niki I, Kenna S, Weng L, Skeer L, Coles B, AshcroftFM (1993), “ The -cell sulfonylurea receptor ’’,Adv Exp Med Biol. ; 334: 47-61. 13.Barelli, Giulio; De, Regis Massimo (1997),“ A glibenclamide- metformincombination for the treatment of diabetes mellitus type II.PCT Int. Appl ’’ , 24 pp. CODEN: PIXXD2 WO 9717975 A1 19970522.
14.Dipalma J. R (1971), “ Diabetes mellitus, Drill's pharmacology in medicine’’, McGraw-Hill, 1492-1525.
15.Gaines KL, Hamilton S, Boyd AE III.(1988), ‘‘Characterizationof the sulfonylurea receptor on beta cell membranes’’,J Biol Chem ;263: 2589–92. 18.Hokfelt B, Jonsson A (1988), “ Hypoglycemic activity in relationto chemical structure of potential oral antidiabetic substances ’’, I. 1-Sulfonyl- 3-alkylureas. J
16.http://www.fda.gov/bbs/topics/ANSWERS/ANS00627.html"FDA Approves New Diabetes Drug "
17.Hadad SM, Fleming S, Thompson AM ,Targeting AMPK (2008), “A newtherapeutic opportunity in breast cancer ’’, Crit Rev Oncol Hematol 67:1–7 .
18.Lara Ochoa, Jose Manuel Francisco; De la Torre Garcia, JuanAntonio; Franco Andrade, Fidencio (publication date 25-01-2001), “Improved processfor the preparation of benzenesulfonylureas used as second- generation oral hypoglycemic agents’’,PCT patent W 0015354 (A2).
19.Meyer M, Chudziak F, Schwanstecher C, Schwanstecher M, PantenU (1999),‘‘Structural requirements of sulphonylureas and analogues for in- teractionwith sulphonylurea receptor subtypes’’, Br J Pharmacol ; 128:27–34.
20.Niki I, Welsh M, Berggren PO, Hubbard P, Ashcroft SJ.(1991), ‘‘Characterization of the solubilized glibenclamide receptor in a hamster pancreaticbeta-cell line’’, HIT T15. Biochem J ;277:619–24.
21.Proks P, Reimann F, Green N, Gribble F, Ashcroft F (2002),Sulfonylurea stimulation of insulin secretion. Diabetes, ;51(suppl 3):368–76.
22.Panten U, Schwanstecher M, Schwanstecher C (1992),“ Pancreatic andextrapancreatic sulfonylurea receptors’’,Horm Metab Res;24:549– 54. 23.Rao, N. K. và các cộng sự (2007) , “ JASA ’’, 3, 43-45.