ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH CÂY

CHUYỂN GEN

Gen chuyển sau khi được biến nạp vào tế bào có thể tồn tại trong tế bào chủ ở dạng DNA tự do, dạng thể plasmid độc lập và ổn định như một đoạn DNA của hệ gen trong tế bào chủ và được nhân lên trong tế bào chủ. Trong

chuyển gen, trạng thái mong đợi nhất là tính bền vững của thể biến nạp. Các

kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng nhằm xác định sự có mặt, sự di truyền và sự biểu hiện của gen chuyển trong tế bào chủ [5].

Để xác định sự có mặt của gen chuyển có thể sử dụng kỹ thuật PCR; kỹ thuật lai Southern (xác định số bản sao (copy) trong cây chuyển gen) là những phương pháp tin cậy và thông dụng. Gần đây, một kỹ thuật thường sử dụng trong việc phát hiện số bản sao trong cây chuyển gen là Quantitative Real- time PCR (Q-PCR). Q-PCR có thể tiến hành với số lượng cây cần phân tích nhiều do dễ thực hiện, tiết kiệm nguyên liệu chi phí và công sức. Năm 2001, Ingham và cs đã phát triển phương pháp Real-time PCR xác định số bản copy gen chuyển trong hệ gen của cây trồng và thực vật chuyển gen [21]. Năm 2004, Bubner và cs đánh giá hiệu quả của phương pháp Real-time PCR trong việc xác định số bản sao ở thực vật chuyển gen khi phân tích kết hợp với kỹ

thuật Southern blot [23]. Kể từ đó, Real-time PCR được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu nhằm xác định số bản copy gen chuyển và phát hiện thể đồng hợp, dị hợp ở thực vật chuyển gen [23].

Biểu hiện gen là quá trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein. Quá trình biểu hiện gen được thể hiện qua hai giai đoạn: phiên mã từ DNA sang mRNA và dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân tử protein thông qua bộ máy ribosome. Để xác định sự có mặt sản phẩm phiên mã của gen ngoại lai có thể sử dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen chuyển và khuôn là cDNA từ RNA tổng số của cây cần kiểm tra. Ngoài ra, có thể sử dụng kỹ thuật lai Northern giữa mẫu dò là đoạn DNA của gen đánh dấu huỳnh quang với RNA toàn phần của mô cây chuyển gen. [21]. Thực hiện xác định hoạt động của gen chuyển tạo sản phẩm cuối cùng bằng kỹ thuật lai Western giữa protein của cây chuyển gen với kháng thể đặc hiệu. Một kỹ thuật khác là ELISA phát triển dựa trên nguyên lý ngưng kết kháng nguyên - kháng thể và phản ứng tạo màu của cơ chất với enzyme gắn trên kháng thể đặc hiệu. ELISA cho phép phát hiện và xác định được mức độ dịch mã nhờ định lượng protein ngoại lai bằng phương pháp so màu [21].

Một kỹ thuật mới được phát triển gần đây là Real-time RT-PCR nhằm đánh giá mức độ phiên mã cao hay thấp của gen chuyển. Real-time PCR là kỹ

thuật khuếch đa ̣i đoa ̣n DNA đích in vitro mà kết quả được hiện thị ngay sau

mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đó người làm thí nghiệm không phải làm tiếp các thí nghiệm đọc và phân tích kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không, nên được gọi là real- time [21],[24]. Kỹ thuật real-time PCR thường được sử dụng để xác định mức độ phiên mã của một gen cấu trúc. Có hai loại real-time: (1) Real-time polymerase chain reaction (hay quantitative polymerase chain reaction, qPCR) dùng trong định lượng tác

RT-PCR, thường viết tắt là RRT-PCR hoặc qRT-PCR) dùng trong định lượng tác nhân đích là RNA, cDNA, DNA; phương pháp này cần tiến hành qua trung gian tổng hợp cDNA từ RNA nhờ enzyme phiên mã ngược [21]. Phương pháp real- time PCR đang là lựa chọn để phát hiện, xác định số lượng và nghiên cứu quần thể vi sinh vật [24]. Trong khi real- time RT- PCR chỉ mới bắt đầu được áp dụng và có bước triển vọng đột phá trong nghiên cứu bởi các phân tử RNA khó lưu giữ được trong thời gian dài như DNA [21], [37].

Máy real-time PCR có buồng ủ nhiệt như máy PCR thông thườ ng, nhưng có

thêm một thiết bị real-time. Đây là thiết bị quang học có hai chức năng: (1) Có các nguồn sáng phát ra các tia sáng kích thích có bước sóng xác định lên các ống phản ứng; (2) Có camera hay cảm biến quang ghi nhận ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng.

Nguyên lý chủ yếu của Real-time RT-PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng tín hiệu phát xạ thông báo huỳnh quang. Hàm lượng sản phẩm PCR bắt đầu được tăng cao lên từ chu kỳ ngưỡng (Ct) tương quan chặt chẽ với hàm lượng cDNA khuôn ban đầu. Để sử dụng Real-time RT-PCR trong xác định mức độ biểu hiện của gen chuyển, người ta dựa vào mối tương quan giữa giá trị Ct và số copy trong cDNA mẫu ban đầu. Có nhiều phương pháp khác nhau đã được thử nghiệm, có thể so sánh Ct đo được với đường chuẩn thu được từ các nồng độ pha loãng khác nhau của một plasmid mang trình tự gen chuyển mà đã biết trọng lượng phân tử và nồng độ DNA chính xác, từ đó tính tương đối số copy của mẫu cần kiểm tra. Một phương pháp khác tương đối phổ biến và hiệu quả trong việc xác định mức độ biểu hiện gen chuyển bằng Real-time PCR là phương pháp dựa vào giá trị Ct tương đối (2-ΔΔCt). Phương pháp này dựa vào ΔCt là độ chênh lệch giữa Ct của cây chuyển gen và Ct của mẫu chuẩn là mẫu mang gen nội sinh (housekeeping gene) biểu hiện ổn định trong tất cả các mô bào ở các giai đoạn phát triển khác nhau.

Trong cùng một phản ứng Real-time RT-PCR với hiệu suất như nhau, bằng cách làm chuẩn nồng độ cDNA ban đầu đưa vào phản ứng, các mẫu có mức độ biểu hiện gen chuyển khác nhau sẽ cho giá trị ΔCt khác nhau [21]. Hiện nay, kỹ thuật Real-time RT-PCR được thử nghiệm ứng dụng trong lĩnh vực phát hiện, xác định mức độ biểu hiện của gen và theo dõi hiệu quả điều trị ở bệnh nhân ung thư [38] và phát hiện và định lượng sinh vật biến đổi gen [37].

Một hướng phát triển kỹ thuật Real-time RT-PCR là phân tích chức năng gen bằng cách định lượng trực tiếp sản phẩm của gen. Theo hướng này,

sản phẩm phiên mã của các gen điều hoà hoặc các gen chức năng (như TCSs,

GmNAC...) được định lượng trực tiếp và so sánh giữa các giống đậu tương khác nhau trong cùng điều kiện bất lợi (hạn, lạnh, mặn...) bằng kỹ thuật Real- time RT-PCR. Kỹ thuật này cho phép vừa khẳng định được vai trò hoạt động của gen trong điều kiện hạn, vừa xác định được mức độ phản ứng với hạn của mỗi giống đậu tương. Từ đó đánh giá được tiềm năng di truyền của các giống đậu tương có thể sử dụng trong kỹ thuật gen nhằm cải thiện đặc tính chịu hạn [24], [37].

Ngoài ra, cần xác định sự ổn định di truyền của tính trạng được xác định bởi gen chuyển bằng các phương pháp kiểm tra, đánh giá trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng. Giai đoạn này cần phân tích dựa vào sự biểu hiện tính trạng quan tâm hay chức năng sinh học của gen chuyển, qua đó xác định khả năng di truyền, chọn lọc dòng đồng hợp tử về gen chuyển quan tâm nhằm tạo dòng hoặc giống ổn định.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1. Vật liệu

Giống thuốc lá Nicotania tabacum C9-1 đang nuôi cấy trong điều kiện in

vitro do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

Chủng vi khuẩn A. tumefaciens CV58C1 mang cấu trúc pK7GW/SMV-

BYMV-CPi do Đề tài cấp Bô ̣ B2013 (mã số B2013-TN04-08) và Phòng Công

nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghê ̣ sinh học cung cấp.

2.1.2. Hóa chất

Hó a chất đươ ̣c sử dụng cho chuyển gen bao gồ m: bacto tripton, yeast

extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, trypton, KCl, tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol, marker DNA 1kb. Các loại kháng sinh kanamycin, rifamicine, cefotaxime, spectinomycine và các hóa chất thông dụng khác (X- gal,...).

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng, bình nuôi cấy, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH. Một số thiết bị dùng trong phân tích sinh học phân tử như: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser cùng với mô ̣t số trang thiết bị khác.

2.1.4. Đi ̣a điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm chuyển gen ở cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens được tiến hành trên trang thiết bị Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên.

Thí nghiệm phân tích cây thuốc lá chuyển gen được tiến hành ta ̣i Phòng thí nghiê ̣m trọng điểm công nghệ gen, Viê ̣n Công nghê ̣ Sinh học.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens

Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá Nicotania tabacum C9-1

thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58C1 được tiến hành theo

phương pháp của Topping (1998) [51], bao gồm các bước: (i) Chọn vật liệu chuyển gen, (ii) Nuôi chọn lọc khuẩn, (iii) Nuôi phục hồi khuẩn, (iv) biến nạp, (v) tái sinh, (vi) tạo rễ và (vii) ra cây.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại. Các thí

nghiệm của phần nuôi cây mô cây thuố c lá đươ ̣c thực hiện trong phòng nuôi

cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt

độ phòng 25oC ± 2, cường độ chiếu sáng 200 lux. Môi trường nuôi cấy in

vitro thuố c lá đươ ̣c trình bày ở bảng 2.1.

Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens

Lấy chủng khuẩn từ đĩa giữ khuẩn và cấy vạch lên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc (Rifamycine 0,025g/l, spectinomycine 0,1g/l

với chủng A. tumefaciens CV58C1 mang cấu trúc pK7GW/SMV-BYMV-CPi

Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro

Môi trường Thành phần

MS0 MS1(20ml/l) + MS2 (20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) +

MS5(5ml/l) + aga(10g/l) + sucrose (30g/l)

MS1 MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) +

MS5(5ml/l) + aga(10g/l) + sucrose (30g/l)+ BAP(0,001g/l)

GM

MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) + MS5(5ml/l) + aga(10g/l) + sucrose (30g/l) + BAP(0,001g/l) + kanamycin 0,05g/l + cefortaxime 0,4g/l

GMK50

MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) + MS5(5ml/l) + aga(10g/l) + sucrose (30g/l) + BAP(0,001g/l) + kanamycin 0,05g/l + cefotaxime 0,4g/l

RMK50

MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) + MS5(5ml/l) + aga(10g/l) + sucrose (30g/l) + IBA 0,0001g/l. + kanamycin 0,05g/l + cefotaxime 0,4mg/l

Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 20ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc như khi nuôi ở môi

trường LB đặc. Nuôi trong tủ lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 48 giờ. Sau 2

ngày nuôi phục hồi khuẩn trong môi trường không kháng sinh, bổ sung thêm

20ml. LB lỏng đem nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 3 – 5giờ.

Lấy khoảng 1,5 – 2,0 ml dịch khuẩn và môi trường LB lỏng dùng để

nuôi khuẩn như trên đo OD nếu OD600nm đạt 0.6 - 0.8, đủ điều kiện để biến

nạp vào mảnh lá thuốc lá.

Ly tâm 5.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, bỏ dịch nổi, thu sinh khối

Tạo nguyên liệu chuyển gen

Sử du ̣ng lá cây thuốc lá và đoa ̣n thân để tái sinh cây in vitro. Sau 2-3 tuần cây con được khoảng 3-4 lá thật thì chọn lá bánh tẻ ở các cây con khỏe mạnh. Dùng dao cắt bốn cạnh mép lá để gây tổn thương tạo thành mảnh lá có

hình vuông 1cm2 (cắt bỏ đường gân giữa của lá). Lá bị tổn thương được đặt

úp cảm ứng trên 150ml môi trường MS0 + 1BAP trong 2 ngày.

Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cây

Sau 48 giờ, 80 mẫu lá đã chuẩn bị ở trên đươ ̣c ngâm trong dịch huyền

phù vi khuẩn có nồng độ OD600nm đạt 0,6 – 0,8 có lắc nhẹ trong thời gian 20

phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được đặt ngửa lên môi trường đồng

nuôi cấy GM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời

gian là 48 giờ.

Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen

Sau thời gian đồng nuôi cấy, ngâm và lắc các mảnh lá biến nạp trong dung dịch 1/2MS1 có bổ sung cefotaxime (0,4g/l) trong 10 đến 20 phút. Thấm khô 2 mặt các mảnh lá, chuyển sang môi trường GM (BAP – 0,001g/l) có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 0,05g/l, cefortaxime 0,4g/l để tái sinh.

Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình/cụm sau thời gian 4-5 tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi của giống thuốc lá. Các cụm chồi được tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trường GM được cắt chuyển sang môi trường kéo dài chồi GMK50 có bổ sung kanamycin 0,05g/l và cefotaxime 0,4g/l.

Tạo rễ và cây hoàn chỉnh

Khi các chồi đạt chiều cao từ 2-3cm, chọn những cụm phân hóa mạnh sau đó tách những chồi độc lập cấy chuyển sang môi trường ra rễ RMK50 có bổ sung kanamycin 0,05g/l và cefotaxime 0,4mg/l.

Khi cây in vitro có 3-4 lá, có bộ rễ đảm bảo (thường sau 2 tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây được lấy ra khỏi bình nuôi cấy một cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây được bầu trấu - cát (1 : 1).

Cây con 4 - 5 lá thật được đưa ra trồng trên chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lưới.

2.2.2. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen pK7GW/SMV- BYMV-CPi bằng phương pháp PCR

Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số từ các mẫu lá non được tách chiết theo phương pháp của Saghai và cộng sự (1984) [44] với thành phần đệm chiết ở bảng 2.2.

Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số

STT Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng 1 Tris-HCl 1M, pH 8 100 mM 2 NaCl 5M 1,4M 3 EDTA 0,5M, PH 8 50 mM 4 CTAB 2% (w/v) 5 Nước khử ion

Các bước tiến hành:

(1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào

ống Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl dung dịch đệm tách, đảo đều và ủ ở 65oC

trong 90 phút.

(2) Bổ sung 700µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút.

(3) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống eppendorf khác, bổ sung 500 µl

isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút.

(4) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó

rửa tủa bằng cồn 70oC.

(5) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA

trong nước khử ion vô trùng và bảo quản ở -20oC.

Kiểm tra hàm lượng và độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp điện di

Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.

Khuếch đại đoạn gen CPi-SMV-BYMV

DNA tổng số tách chiết từ lá thuốc lá được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sử có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0%.

Khuếch đại đoạn gen CPi-SMV bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri có trình tự nucleotide thể hiê ̣n ở bảng 2.3.

Bả ng 2.3. Trình tự nucleotide của cặp mồ i PCR khuếch đại đoa ̣n CPi

Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide

SMV-CPi-Fi 5’- CACCGCAGCAGAAGCTTACA -3’

BYMV-CPi-Ri 5’- ATGTTCCGAACCCCAAGCAA-3’

Thành phần phản ứng PCR nhân bản đoạn gen Cpi (SMV-BYMV)

đươ ̣c trình bày ở bảng 2.4.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen CPi

STT Thành phần Thể tích (xl) (µl) 1 Nước khử ion 8,6µl 2 Master Mix 12,5µl 3 SMV-CPi-Fi (10pmol/µl) 0,7µl 4 BYMV-CPi-Ri (10pmol/µl) 0,7µl 5 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 2,5µl Tổng Tổng thể tích 25µl

2.2.3. Lây nhiễm nhân tạo SMV và BYMV vào lá cây thuốc lá

Các cây chuyển gen trồng trong nhà lưới sau 2-3 tuần sinh trưởng có 5 - 6 lá thật, kích thước lá khoảng 10 cm được thử nghiệm đánh giá khả năng kháng SMV và BYMV bằng lây nhiễm nhân tạo theo phương pháp