3. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro
2.2.1.1. Phương pháp pha môi trường nuôi cấy
Sau khi xác định công thức môi trường cần pha, tính dung tích môi trường cần dùng cho mỗi công thức và tính thể tích các hóa chất cần sử du ̣ng trong môi trường nuôi cấy tiến hành pha môi trường. Ví dụ: pha một lít môi trường nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng đến sự nảy mầm của hạt gồm MS cơ bản + sucrose 30g/l + agar 9g/l. Môi trường sau khi pha được đun nóng 70oC-80oC. Độ pH môi trường nuôi cấy 5,6- 5,8. Chia đều hỗn hợp dung dịch nuôi cấy cho các bình tam giác, mỗi bình 50ml môi trường. Sau đó nút bông và làm nắp bằng giấy, đậy kín. Khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 120oC, áp suất 1-1,2atm, trong thời gian 20 phút. Sau khi hấp khử trùng xong để môi trường 2-3 ngày thì bắt đầu sử du ̣ng.
2.2.1.2. Phương pháp khử trùng hạt
Gồm các bước:
- Rửa hạt bằng nước máy, ngâm trong nước xà phòng loãng. Sau đó, rửa bỏ xà phòng bằng nước máy.
- Khử trùng bằng cồn 70% trong thời gian 1-2 phút. Rửa bỏ cồn bằng nước cất 2 lần.
- Khử trùng bằng nước Javen 60% ở các mức thời gian 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút. Rửa lại bằng nước cất 3 lần, mỗi lần 1 phút.
Hạt sau khi được khử trùng tiến hành cấy vào môi trường MS cơ bản. Để thấy được ảnh hưởng của loại mẫu cấy đến khả năng nảy mầm sau khử trùng, chúng tôi tiến hành các nghiên cứu trên mẫu cấy như sau: (1) mẫu hạt đã khử trùng để nguyên không bóc vỏ; (2) mẫu hạt đã khử trùng bóc vỏ giữ nguyên phôi nhũ; (3) mẫu hạt đã khử trùng bóc vỏ và cắt 1/3 phôi nhũ phía đối diện với phôi. Mỗi loại mẫu cấy, ở mỗi thời gian khử trùng cấy 5 bình, mỗi bình 8 hạt. Đánh giá kết quả sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu nhiễm (%); Tỉ lệ mẫu nảy mầm không bị nhiễm (%), màu sắc thân và lá.
2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy
Ảnh hưởng riêng rẽ của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin tới khả năng phát sinh chồi của giống quýt Bắc Kạn
Để tìm được môi trường nhân giống phù hợp đối với giống quýt Bắc Kạn, chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng của BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi của cây quýt Bắc Kạn. Các đoạn gốc thân mang nách lá mầm thu được từ việc cấy hạt đã khử trùng, được cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung aga 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l+ BAP (nồng độ 2,0mg/l, 2,5mg/l, 3,0mg/l, 3,5mg/l, 4,0mg/l) hoặc kinetin (nồng độ 2,0mg/l, 2,5mg/l, 3,0mg/l, 3,5mg/l, 4,0mg/l). Mỗi công thức tiến hành trên 5 bình, mỗi bình cấy 6 mẫu, các công thức bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần. Đối chứng là môi trường MS cơ bản, bổ sung aga 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l. Đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy. Các chỉ tiêu theo dõi: số mẫu ra chồi, số chồi/mẫu, màu sắc thân và lá của chồi. Kết quả của thí nghiệm này sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Ảnh hưởng tổ hợp giữa nhóm auxin và cytokinin đến khả năng phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn
Từ kết quả nồng độ BAP và kinetin tốt nhất cho sự hình thành chồi, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng
Bắc Kạn. Dùng nồng độ BAP và kinetin tối ưu ở thí nghiệm trên kết hợp với IBA nồng độ 0,5mg/l, 1,0mg/l, 1,5mg/l, 2,0mg/l, 2,5mg/l. Đối chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung chất kích thích sinh trưởng. Mỗi công thức pha 5 bình, mỗi bình cấy 6 mẫu, các công thức bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần. Theo dõi, đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ phát sinh chồi; số chồi/mẫu, chất lượng chồi.
Phương pháp nghiên cứu môi trường ra rễ (tạo cây hoàn chỉnh)
Những chồi tạo ra trên môi trường nhân chồi có kích thước 1,5cm - 2,0cm, được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ gồm MS cơ bản bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l + α-NAA với nồng độ 0,3mg/l, 0,5mg/l, 0,7mg/l, 0,9mg/l, 1,2mg/l. Với mỗi nồng độ cấy 30 mẫu tiến hành trên 5 bình, các cong thức bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ chồi phát sinh rễ, số rễ/mẫu, chiều dài rễ, chất lượng rễ.