loãng tới hạn.
Mẫu nước và bùn nhiễm chì được pha loãng theo tỷ lệ 1:10 trong dung dịch muối sinh lý (0,85% NaCl) vô trùng. Hút 1 ml mẫu vào 9 ml dung dịch muối sinh lý được độ pha loãng 10-1. Tùy theo mật độ vi sinh vật mà ta tiếp tục pha loãng đến nồng độ phù hợp (10-3, 10-4, 10-5, 10-6...).
Hút 1 ml dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau vào ống Hungate kỵ khí chứa 9 ml môi trường PB cải tiến (mỗi nồng độ lặp lại 3 lần). Vi khuẩn KSF được nuôi cấy ở 30oC trong vòng từ 7 đến 14 ngày. Số lượng vi khẩn KSF được xác định bằng phương pháp xắc suất thống kê thông qua kết tủa FeS màu đen được tạo bởi phản ứng giữa sulfide do vi khuẩn KSF tạo ra và Fe2+ trong môi trường nuôi cấy.
2.2.2. Sàng lọc và lựa chọn hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF có khả năng chống chịu chì cao.
Khả năng chống chịu chì của các hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF được đánh giá qua sự sinh trưởng của chúng sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PC cải tiến bổ sung chì với hàm lượng khác nhau (0, 25, 50, 100, 150, và 200 mg/l). Khả năng chống chịu chì của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF có thể đánh giá dựa vào kết tủa FeS và hàm lượng sulfide do chúng tạo ra.
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sinh trưởng và hiệu quả loại chì của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF lựa chọn
Ảnh hưởng của pH tới sinh trưởng của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF lựa chọn được đánh giá trên môi trường PC cải tiến (Bảng 2.1). Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện kỵ khí với nhiệt độ 30oC và giá trị pH khác nhau (3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 và 10), tỷ lệ tiếp giống là 5% (v/v) vi khuẩn KSF. Sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF được đánh giá dựa trên hàm lượng sulfide tạo ra và hàm lượng sulfate được khử trong 12 ngày thí nghiệm.
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF lựa chọn
Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF lựa chọn được đánh giá trên môi trường PC cải tiến (Bảng 2.1). Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện kỵ khí với pH 7,5 và nhiệt độ khác nhau (25, 30, 37, 42 và
55oC). Tỷ lệ tiếp giống là 5% (v/v) vi khuẩn KSF. Sinh trưởng của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF được đánh giá dựa trên hàm lượng sulfide tạo ra và hàm lượng sulfate được khử trong 12 ngày thí nghiệm.
2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon tới sinh trưởng của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF lựa chọn
Ảnh hưởng của tỷ lệ carbon/SO42- tới sinh trưởng của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF lựa chọn được đánh giá trên môi trường PC cải tiến với các nguồn cơ chất khác nhau (lactate, ethanol, acetate, benzoate, methanol, glucose và citrate). Hàm lượng sulfate trong môi trường khoáng không đổi (2000 mg/l) sao cho tỷ lệ carbon/SO42- là 0,67; 1; 1,5; 2; 2,5 và 3. Riêng tỷ lệ lactate/SO42- và ethanol/SO42- là 0,67; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 5 và 6. Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện kỵ khí với nhiệt độ 30oC, pH 7,5. Tỷ lệ tiếp giống là 5% (v/v) vi khuẩn KSF. Sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF được đánh giá dựa trên hàm lượng sulfide tạo ra và hàm lượng sulfate được khử trong 12 ngày.
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của chì tới sinh trưởng của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF lựa chọn
Để lựa chọn hàm lượng chì phù hợp cho sinh trưởng của hỗn chủng vi khuẩn KSF lựa chọn. Vi khuẩn KSF được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung chì với hàm lượng khác nhau (0, 50, 100, 200 và 300 mg/l) bằng dung dịch muối Pb(NO3)2 lọc qua màng vô trùng (0,22 µm). Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện kỵ khí với nhiệt độ 30oC, pH 7,5. Tỷ lệ tiếp giống là 5% (v/v) vi khuẩn KSF. Hàm lượng chì hòa tan (Pb2+), hàm lượng sulfide và sulfate được xác định trong 12 ngày thí nghiệm.
2.2.7. Các phương pháp phân tích. 2.2.7.1. Xác định hàm lượng chì
Hàm lượng chì hòa tan (Pb2+) được phân tích bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS - Atomic Absorption Spectrophotometer) theo phương pháp tiêu chuẩn, dưới sự giúp đỡ của Phòng phân tích độc chất môi trường, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [13].
2.2.7.2. Xác định hàm lượng sulfate
Hàm lượng SO42- hòa tan được xác định bằng đo độ đục dựa vào kết tủa của BaSO4[13].
2.2.7.3. Xác định hàm lượng sulfide
Hàm lượng sulfide hòa tan được đo ngay sau khi lấy mẫu bằng phương pháp so màu dựa trên kết tủa CuS [13].
2.2.7.4. Đo giá trị pH
Giá trị pH được xác định bằng máy đo Testo 7 (Đức).
2.2.7.5. Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning Electron Microscope)
Li tâm dịch nuôi cấy chứa vi khuẩn KSF 6000 vòng trong 5 phút. Hút bỏ pha trên và thu sinh khối. Bổ sung 0,5 ml dung dịch cố định mẫu glutaraldehyde 2,5% và trộn đều bằng pipet. Chuẩn bị lamen vô trùng rửa axit và cồn, sau đó trải polylizin 1% lên để làm đệm bám dính vi khuẩn.
Trộn đều dung dịch đã cố định trên và trải đều các lớp mỏng trên lamen đã có polylizin, không để tạo bọt, để khô trong 15 phút đến khi bề mặt se hẳn (tránh để quá khô). Dùng dung dịch rửa PBS hoặc cacohydrate 0,1M để rửa các mẫu lamen, ngâm trong 5 phút, lặp lại 2 lần bước này và để khô. Tiếp tục sử dụng dung dịch cố định khác là OsO4 1% để cố định lại mẫu sau khi đã rửa trong 10 - 15 phút. Rửa lại mẫu sau khi cố định bằng 5 dung dịch cồn với nồng độ khác
nhau 50%, 70%, 80%, 90% và 100% trong 5 phút, riêng dung dịch cồn 100% lặp lại 2 lần. Để khô, phủ ion mẫu, đưa lên kính SEM (S-4800, Nhật Bản) quan sát và chụp ảnh mẫu.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nuôi cấy làm giàu các hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF từ các mẫu bùn và nước nhiễm chì
17 hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF được nuôi cấy làm giàu trên môi trường PB
cải tiến từ 34 mẫu nước và bùn nhiễm chì thu được tại thôn Đông Mai, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên. Sự sinh trưởng của các hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF này được nhận biết qua kết tủa FeS có màu đen (Hình 3.1).
Hình 3.1. Vi khuẩn KSF thu được từ các mẫu bùn và nước nhiễm chì
3.2. Sàng lọc và lựa chọn hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF có khả năng chống chịu chì cao
17 hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF (ký hiệu DM1 - DM17) được nuôi cấy trong môi trường PC cải tiến bổ sung chì với hàm lượng khác nhau (0, 25, 50, 100, 150, 200 mg/l) bằng dung dịch Pb(NO3)2 lọc qua màng vô trùng (0,22 µm). Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện kỵ khí với pH 7,2, 30oC và tỷ lệ tiếp giống 5% vi khuẩn KSF. Khả năng chống chịu chì của các hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF này được đánh giá dựa trên sự sinh trưởng của vi khuẩn KSF thông
qua kết tủa FeS màu đen (Bảng 3.1 và Hình 3.2) và hàm lượng sulfide tạo ra (Hình 3.3).
Bảng 3.1. Khả năng chống chịu chì của 17 hỗn hợp chủng vi khuẩn KSFsau 7 ngày thí nghiệm
Pb
(mg/l) Sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF
DM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 0 + + + + + + + + + + + + + + + + + 25 +/- + + + + + + -/+ + + + + +/- -/+ + +/- -/+ 50 - + +/- -/+ + + + - - + + - - - + - - 100 - - -/+ - + -/+ +/- - - + -/+ - - - +/- - - 150 - - - - +/- - - +/- - - - 200 - - - -
(+). Sinh trưởng tốt; (-). Không sinh trưởng; (+/-). Sinh trưởng trung bình; (-/+). Sinh trưởng yếu
Hình 3.2. Sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10 trên môi trường bổ sung chì với hàm lượng khác nhau sau 7 ngày thí nghiệm
Kết quả nghiên cứu khả năng chống chịu chì của các hỗn hợp chủng thu được tại thôn Đông Mai (Bảng 3.1) cho thấy, trong số 17 hỗn hợp chủng vi khuẩn nghiên cứu, có 11 hỗn hợp chủng sinh trưởng tốt trong môi trường bổ sung chì với hàm lượng 25 mg/l; 6 hỗn hợp chủng sinh trưởng tốt trong môi
trường bổ sung chì với hàm lượng là 50 mg/l. Đặc biệt, khả năng chống chịu chì của hỗn hợp chủng DM5 và DM10 là cao nhất lên tới 150 mg/l.
Tuy hỗn hợp chủng DM5 và DM10 đều có khả năng chống chịu chì cao, nhưng hỗn hợp chủng DM10 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo do hàm lượng sulfide tạo ra sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường bổ sung 150 mg chì/l cao hơn hỗn hợp chủng DM5. Hàm lượng sulfide tạo ra của DM5 và DM10 sau 7 ngày trong môi trường bổ sung 150 mg chì/l lần lượt là 110 mg/l và 180 mg/l.
Hình 3.3. Hàm lượng sulfide tạo ra từ 17 hỗn hợp chủng vi khuẩn KSFsau 7 ngày nuôi cấy
3.3. Hình thái tế bào hỗn hợp chủng vi khuẩn DM10 dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning Electron Microscope)
Hình thái tế bào của chủng nghiên cứu được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét. Ở độ phóng đại 10.000 lần, tế bào vi khuẩn KSF của hỗn hợp chủng DM10 có hình que (Hình 3.4).
Hình 3.4. Ảnh hưởng của chì tới hình thái tế bào hỗn hợp chủng DM10 Môi trường có bổ sung chì với hàm
lượng 200 mg/l
Môi trường không bổ sung chì
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10
pH là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn KSF cũng như hiệu quả xử lý nước thải nhiễm kim loại nặng nói chung và chì nói riêng của nhóm vi khuẩn này. Như đã đề cập ở trên (Mục 1.3.2.3), với từng loại vi khuẩn KSF khác nhau thì pH tối ưu là không giống nhau. Vì vậy, để tìm khoảng pH tối ưu cho hỗn hợp chủng DM10, chúng tôi tiến hành nuôi cấy hỗn hợp chủng này ở điều kiện nhiệt độ 30oC, với các giá trị pH khác nhau (pH 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5; 10). Kết quả ở Hình 3.5 và 3.6 cho thấy hỗn hợp chủng DM10 có khả năng sinh trưởng ở dải pH rộng từ 5 - 9, tối ưu ở pH trung tính hơi kiềm (pH 7 - 7,5). Với pH 7 - 7,5 hiệu quả khử sulfate và tạo sulfide của hỗn hợp chủng DM10 là cao nhất, với 73 - 79% hàm lượng SO42-
được khử sau 12 ngày thí nghiệm, hàm lượng sulfide tạo ra ở mức cao 423 - 459 mg/l sau 8 ngày. Vì vậy, chúng tôi chọn pH 7,5 cho các nghiên cứu tiếp theo của hỗn hợp chủng DM10.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH lên khả năng tạo sulfidecủa hỗn hợp chủng DM10
Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH lên khả năng khử sulfate của hỗn hợp chủng DM10
3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10
Để biết được ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng này ở pH 7,5; với các nhiệt độ 25; 30; 37; 42 và 55oC. Kết quả ở hình 3.7 và 3.8 cho thấy, chủng DM10 sinh trưởng tốt ở dải nhiệt độ từ 25 - 37oC và sinh trưởng tối ưu ở 30oC. Điều này được chứng minh bởi hiệu quả khử sulfate (58 - 79%) và hàm lượng sulfide tạo ra trong suốt 12 ngày thí nghiệm là 512 - 459 mg/l. Vì vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ 30oC cho các nghiên cứu tiếp theo của hỗn hợp chủng DM10.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tạo sulfidecủa hỗn hợp chủng DM10
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng khử sulfate của hỗn hợp chủng DM10
3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn carbon tới sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10
Nguồn carbon và tỷ lệ giữa hàm lượng carbon với sulfate (SO42-) là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn KSF. Vì vậy, trong nghiên cứu này ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau như lactate, ethanol, acetate, benzoate, methanol, glucose và citrate và tỷ lệ của chúng với SO42- tới sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10 được đánh giá thông qua hàm lượng sulfide tạo ra và hàm lượng sulfate được khử. Thí nghiệm được tiến hành ở 30oC, pH 7,5
3.6.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/SO42- tới sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10
Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/SO42- tới sự sinh trưởng hỗn hợp chủng DM10 được thể hiện ở hình 3.9, 3.10 và 3.11. Kết quả cho thấy, khi tỷ lệ ethanol/sulfate trong môi trường tăng từ 0,67 đến 6, 42 - 85% lượng sulfate ban đầu được chuyển hóa thành sulfide với hàm lượng dao động từ 173 đến 416 mg/l sau 6 ngày nuôi cấy. Ở tỷ lệ ethanol/SO42- là 2,5, hàm lượng sulfide tạo ra (416 - 423 mg/l) và sulfate được chuyển hóa (84 - 85%) là cao nhất. Tuy nhiên,
hàm lượng sulfide tạo ra bởi hỗn hợp chủng DM10 tăng dần khi tỷ lệ ethanol/SO42- tăng từ 0,67 đến 2,5, cao nhất ở tỷ lệ ethanol/SO42- từ 1,5 đến 2,5 .Hàm lượng này giảm dần khi tỷ lệ ethanol/sulfate từ 3 đến 6 (hình 3.10) Ở tỷ lệ ethanol/sulfate là 6, hàm lượng sulfide là 245 mg/l, chỉ bằng một nửa tỷ lệ ethanol/SO42- là 2,5 sau 8 ngày nuôi cấy. Hàm lượng sulfide giảm dần có thể là do khi tỷ lệ ethanol/SO42- cao, hàm lượng ethanol trong môi trường dư thừa khiến vi khuẩn KSF bị ức chế.
Hình 3.9. Hỗn hợp chủng DM10 trên môi trường với tỷ lệ ethanol/SO42-
khác nhau sau 12 ngày
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/SO42- tới khả năng tạo sulfide của hỗn hợp chủng DM10
Hình 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/SO42- tới khả năng khử sulfate của hỗn hợp chủng DM10
3.6.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ lactate/SO42- tới sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10
Ảnh hưởng của tỷ lệ lactate/SO42- tới sự sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10 được thể hiện ở hình 3.12 và 3.13. Kết quả cho thấy, khi tỷ lệ lactate/SO42- trong môi trường tăng từ 0,67 đến 6, 46 - 92% lượng sulfate ban đầu được chuyển hóa thành sulfide với hàm lượng dao động từ 143 đến 456 mg/l sau 8 ngày nuôi cấy. Trong đó, hàm lượng sulfide tạo ra (415 - 456 mg/l) và sulfate được chuyển hóa (91 - 92%) ở tỷ lệ lactate/SO42- từ 2,5 đến 4 là cao nhất. Tuy nhiên, hàm lượng sulfide tạo ra bởi hỗn hợp chủng DM10 tăng dần khi tỷ lệ lactate/SO42- tăng từ 0,67 đến 4 và hàm lượng này giảm dần khi tỷ lệ lactate/SO42- là >4 (Hình 3.12). Ở tỷ lệ lactate/SO42- là 6, hàm lượng sulfide là 210 mg/l, chỉ bằng một nửa khi tỷ lệ lactate/SO42- từ 2,5 đến 4 sau 8 ngày nuôi cấy. Điều này có thể được giải thích là do vi khuẩn KSF bị ức chế trong môi trường có hàm lượng chất hữu cơ cao.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ lactate/SO42- tới khả năng tạo sulfide của hỗn hợp chủng DM10
Hình 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ lactate/SO42- tới khả năng khử sulfatecủa hỗn hợp chủng DM10
3.6.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ acetate/SO42- tới sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10
Kết quả (hình 3.14 và 3.15) cho thấy, hỗn hợp chủng vi khuẩn KSF DM10 sinh trưởng yếu trên môi trường bổ sung acetate như nguồn carbon. Hàm lượng sulfide tạo ra (14 - 89 mg/l) và hàm lượng sulfate được khử (11- 21%) trong suốt
12 ngày nuôi cấy ở mức thấp hơn nhiều so với khi hỗn hợp chủng này được nuôi cấy trên môi trường bổ sung nguồn carbon là lactate và ethanol. Ở ngày thứ 8, hỗn hợp chủng DM10 sinh trưởng tốt nhất, tuy nhiên, hàm lượng sulfide tạo ra (41- 89 mg/l) và sulfate được khử (15 - 21%) vẫn ở mức thấp.
Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ acetate/SO42- tới khả năng tạo sulfidecủa hỗn hợp chủng DM10
Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ acetate/SO42- tới khả năng khử sulfate của hỗn hợp chủng DM10
3.6.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ benzoate/SO42- tới sinh trưởng của hỗn hợp chủng DM10
Hỗn hợp chủng DM10 sinh trưởng không tốt trên môi trường bổ sung benzoate (Hình 3.16 và 3.17). Hàm lượng sulfide tạo ra (16 - 68 mg/l) và hàm lượng sulfate được khử (12 - 24%) trong suốt 12 ngày nuôi cấy ở mức thấp.