4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
3.2. Thiết kế marker xác định gen ứng viên kháng bạc lá xa5
Dựa vào sự sai khác về trình tự đoạn gen kháng bạc lá xa5 giữa các giống lúa bản địa đã đọc trình tự với gen xa5 kháng bạc lá đã công bố trên thế giới, sử dụng phần mềm Vector NTI v11.0 đã thiết kế được một số cặp mồi:
1.
3.
4.
6.
Sau khi chạy điện di kiểm tra chất lượng các cặp mồi chúng tôi chọn cặp mồi số 6 và đặt tên là đặt tên là xa5_add35 có trình tự: Xa5_add35F: TAGTGGCATGGGAAATATGG/Xa5_add35R:TAGGAGAAACTAGCCGTC CA, khuếch đại đoạn nucleotide có chiều dài 179 bp với các thông số kỹ thuật đảm bảo các yêu cầu về thiết kế mồi, đồng thời phát hiện được đoạn gen ứng viên kháng (candidate gen) giống và khác nhau với công bố của thế giới, băng chạy điện di rất rõ ràng.
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra PCR đối với mồi xa5add35F/xa5add35R nhận biết gen xa5 ở các giống lúa bản địa của Việt Nam
Theo thiết kế mồi và so sánh với gen tham chiếu của thế giới đã công bố thì khi thực hiện phản ứng PCR có các khả năng sau xảy ra: nếu tiến hành phản ứng PCR cặp mồi xa5add35 có sự xuất hiện của hai loại băng: băng kích thước 179 bp, nghĩa là các giống này mang candidate xa5 (có vùng CDS giống hệt và có kích thước lớn hơn 35 nucleotide),băng kích thước 144 bp nghĩa là các giống này mang candidate xa5 có vùng CDS ngắn hơn 35 nucleotide. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 36 giống đã giải mã cho thấy có 19 giống lúa nghiên cứu xuất hiện băng kích thước 179 bp, đó là các giống: Tẻ Nương, Ble te lo, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Khấu mặc buộc, OM6377, Chấn thơm, Khâu giáng, Coi ba đất, Nếp bồ hóng Hải Dương, Ba cho K‟te, Blào sinh sái, Tép Thái Bình, Khấu điển lư, Nếp mèo nương, Tốc lùn, Hom râu, Khẩu Liến, Chiêm đá và IS1.2. Điều này có nghĩa là các giống này mang candidate gen xa5 ở trạng thái đồng hợp. Chỉ có 1 giống duy nhất mang candidate gen xa5 ở trạng thái dị hợp đó là giống Tám xoan Bắc Ninh, nghĩa là có sự xuất hiện của băng kích thước 179bp và 144 bp;
có 14 giống nghiên cứu xuất hiện băng kích thước 144 bp là: Tám xoan Hải Hậu, Nàng thơm chợ đào, Thơm Lài, Nếp mặn, Một bụi đỏ, Nàng cờ đỏ 2, Nếp lùn, Xương gà, OM5629, Tan Ngần, Nàng quớt biển, Nếp ông táo, OM3536, Lúa gốc đỏ, những giống này không chứa candidate gen xa5.