Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công bố nào nghiên cứu về các đặc tính sinh hóa và tác dụng sinh học của polisaccarit từ cây thuốc Xuân Hoa P. palatiferum. 0 20 40 60 80 100 120 Nhiệt độ ( °C) % p o lis ac ca ri t tươ n g đ ố i 50 60 70 80 90 100
Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu, đánh giá một số tác dụng sinh học của protease từ cây thuốc: hoạt tính quét các gốc tự do, kháng viêm, làm lành vết thương và tăng khả năng miễn dịch.
3.5.1. Xác định hoạt tính quét các gốc tự do
Bảng 3.5. Xác định hoạt tính quét các gốc tự do sử dụng phương pháp DPPH
STT Tên mẫu Giá trị EC50(µg/ml)
Mẫu Polisaccarit tinh sạch được
từ lá cây Xuân Hoa >128
Đối chứng Resveratrol 8.3
1,1-diphenyl-2 icrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxi hóa của các chất nghiên cứu. Kết quả bảng 3.5 cho thấy polisaccarit tinh sạch trong lá cây Xuân Hoa P. palatiferum không có hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH.
3.5.2. Đánh giá hoạt tính độc tố của polisaccarit tới khả năng sống của tế bào macrophage
Ảnh hưởng của polisaccarit tinh sạch từ cây Xuân Hoa P. Palatiferum
(XH) (lên khả năng sống xót của đại thực bào RAW264.7 được xác định bằng thí nghiệm MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyltetrazolium bromide).
Khả năng sống xót của tế bào tại các giếng được tra thuốc XH tại các nồng độ 10, 20, 30 µg/ml không có sự khác biệt đáng kể so với khả năng sống xót của tế bào tại giếng đối chứng sinh học (giếng tế bào chỉ nuôi trong môi trường nuôi cấy) (Hình 3.12).
Kết quả này cho thấy polisaccarit tinh sạch không có khả năng gây độc với đại thực bào. Nồng độ này sẽ được sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của polisaccarit lên khả năng sống chết của tế bào RAW264.7
P> 0,05 ( không có sự sai khác giữa các nhóm)
3.5.3. Đánh giá ảnh hưởng của polisaccarit đến sự giải phóng cytokine
Trong những năm gần đây polisaccarit là những nhóm hợp chất rất được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm do các tác dụng quan trọng của chúng về tăng cường miễn dịch, chống ung thư, chống oxi hóa. Nhiều nghiên cứu cho thấy các polisaccarit từ thực vật có khả năng điều hòa miễn dịch (Indranil, 2011), kháng viêm.
Để đánh giá hiệu quả polisaccarit tinh sạch từ cây Xuân Hoa P. Palatiferum trong quá trình này, Polisaccarit ở các nồng độ 5, 10 µg/ml trong môi trường nuôi cấy và tra vào các giếng tế bào RAW 264.7. Cảm ứng đại thực bào RAW 264.7 bằng LPS với nồng độ 1 µg/ml trong 24 giờ theo mô tả chi tiết tại phần phương pháp. Lần lượt thu dịch nổi của từng nồng độ để phục vụ cho các bước tiếp theo của thí nghiệm phân tích cytokine.
Từ hình 3.13 cho thấy tất cả nhóm đại thực bào RAW 264.7 gây cảm ứng đều giải phóng cao hàm lượng IL-6 so với nhóm đối chứng không gây cảm ứng LPS. Polisaccarit tinh sạch từ cây Xuân Hoa P. Palatiferum với nồng độ 10µg/ml đã ức chế một phần sự giải phóng cytokine tiền viêm IL-6 so với nhóm tế bào gây đáp ứng viêm bằng LPS không điều trị (p<0.05) .
Hình 3.13. Ảnh hưởng của polisaccarit tinh sạch trên sự giải phóng của IL-6
#: sự khác nhau có ý nghĩa giữa các nhóm gây cảm ứng LPS (+) so với nhóm đối chứng không gây LPS (-);
*: sự khác nhau có ý nghĩa giữa nhóm LPS điều trị XH (10µg) so với các nhóm LPS không điều trị và LPS điều trị XH (5µg)
Các nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy tác dụng của polisaccarit từ thực vật có khả năng giảm các cytokine tiền viêm ở chuột khi tiêm LPS (Ovodova, 2009; Sherry, 2010). Interleukin-6 đóng vai trò trung tâm trong viêm mạn tính và trong các nhiễm trùng dẫn đến nhiễm khuẩn huyết. Nồng độ Interleukin-6 trong máu tăng cao ở các bệnh nhân viêm mãn tính và bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết. Vì vậy việc ức chế Interleukin-6 là một liệu pháp điều trị hiệu quả đối với các bệnh nhân viêm mạn tính và nhiễm trùng nặng.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Nồng độ XH (µg/ml) Nồng độ IL6 (µg/ml) XH (-) LPS (-) XH (-) LPS (+) XH (5) LPS (+) XH (10) LPS (+) XH (20) LPS (+) XH (40) LPS (+) # * # # # #
Hình 3.14 cho thấy, nhóm gây cảm ứng LPS điều trị polisaccarit XH với nồng độ 5 µg/ml có chiều hướng ức chế sự giải phóng của TNFα so với nhóm không điều trị bằng polisaccarit.
Hình 3.14. Ảnh hưởng của polisaccarit tinh sạch trên sự giải phóng của TNF-α
Trong khuôn khổ luận văn nghiên cứu, chúng tôi chỉ mới bước đầu đánh giá ảnh hưởng của polisaccarit XH trên 2 loại cytokine tiền viêm.
3.5.4. Đánh giá tác dụng làm lành vết thương trên tế bào nguyên sợi da người
Khoảng cách vết rạch trên nguyên bào sợi được xác định tại các thời điểm 0, 4, 8, 12, 24, 48 giờ sau khi tra mẫu polisaccarit XHT tại các nồng độ 0, 50, 100 µg/mL. Kết quả chụp kính hiển vi cho thấy sự xâm lấn, tăng sinh của nguyên bào sợi vào trung tâm vết rạch, khoảng cách vết rạch thu hẹp dần theo thời gian. Tại thời điểm 24 giờ sau tra thuốc, vết rạch thu hẹp đáng kể. Tại thời điểm 48 giờ, các vết rạch đã khép kín hoàn toàn (Hình 3.15).
Tại thời điểm 4, 8, 12 giờ sau khi tra mẫu polisaccarit XH, không có sự khác biệt đáng kể về khoảng cách vết rạch so với đối chứng. Tại thời điểm 24 giờ, các giếng tra thuốc polisaccarit XH tại nồng độ 100 μg/mL có sự thu hẹp vết rạch đáng kể so với đối chứng không tra thuốc tại cùng thời điểm quan sát,
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Nồng độ TNFα (µg/ml) XH (-) LPS (-) XH (-) LPS (+) XH (5) LPS (+) XH (10) LPS (+) XH (20) LPS (+) XH (40) LPS (+) Nồng độ XH (µg/ml) # # # # #
tỷ lệ khoảng cách vết rạch giảm nhanh hơn đối chứng 28,74%, p < 0.05. Tại nồng độ 50 μg/mL không có sự khác biệt đáng kể so với đối chứng tại cùng thời điểm. XH bước đầu thể hiện hiệu quả trong hàn gắn vết thương (Hình 3.16).
Đối chứng 0h Đối chứng 24h
24h điều trị với polisaccarit XH (100µg/ml)
Hình 3.15. Hình ảnh trên kính hiển vi sự hàn gắn vết rạch trên nguyên bào sợi của polisaccarit
Polisaccarit XH bước đầu thể hiện hiệu quả trong hàn gắn vết thương (Hình 3.15).
Một số nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy polisaccarit từ thực vật là nguyên liệu thuốc tiềm năng để làm lành vết thương. Như polisaccarit từ một số cây thuốc đã được chứng minh kích thích sự tăng sinh của tế bào sừng và nguyên bào sợi da. Polysaccharides từ cây Opuntia ficus-indica (L.) cladodes có tác dụng làm lành vết thương trên da chuột (Trombetta, 2006). Polysaccharides tách từ Ganoderma lucidum có tác dụng làm lành vết thương ở da chuột bị tiểu đường gây bởi streptozotocin (Po Guat Cheng, 2013).
Hình 3.16. Mức độ hàn gắn vết rạch của polisaccarit XH trên nguyên bào sợi
(sự khác nhau có ý nghĩa so với nhóm đối chứng không điều trị polisaccarit XH, p<0.05 )
3.5.5. Đánh giá khả năng tăng cường miễn dịch của polisaccarit từ từ cây Xuân Hoa P. Palatiferum
Chuột thí nghiệm được gây suy giảm miễn dịch theo mô hình thí nghiệm của Phan Thị Phi Phi năm 1998 và các cộng sự. Chuột được tiêm cyclophosphamide (CY). Cyclophosphamide là chất gây tổn thương về cấu trúc và chức năng hệ miễn dịch ở chuột. Chuột được tiêm với liều 250mg/kg thể trọng và phúc mạc. 0 20 40 60 80 100 120 Thời gian (h) K h o ản g c ác h v ết rạ ch (% tư ơ n g đ ố i) 0h 4h 8h 12h 24h *
Mục đích của thí nghiệm này nhằm nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch, phục hồi tổn thương cấu trúc và chức năng của hệ miễn dịch ở chuột khi tiêm cyclophosphamide của polisaccarit chiết xuất từ cây Xuân Hoa.
Chuột nhắt trắng dòng Swiss thuần chủng có trọng lượng trung bình từ 2,3-2,5g/con. Chia làm 3 lô mỗi lô 10 con: Lô đối chúng sinh học (lô I), lô đối chứng thí nghiệm (lô II), lô thí nghiệm (lô III).
Lô I tiêm nước cât, lô II, III tiêm cyclophosphamide (CY) với liều 250mg/kg thể trọng vào phúc mạc tại ngày thứ nhất. Lô I và II cho uống nước cất 0,15ml/con/ ngày trong 4 ngày. Lô III cho uống chế phẩm polisaccarit tinh sạch từ lá Xuân Hoa với liều uống 150mg/kg thể trọng chuột trong 4 ngày làm thí nghiệm.
Ngày thứ 5 cân lại trọng lượng và mổ chuột để làm chỉ tiêu sinh hóa.
Bảng 3.6. Sự thay đổi trọng lượng của chuột trong 5 ngày thí nghiệm
* p<0,05 sự khác nhau có ý nghĩa giữa nhóm đối chứng không gây suy giảm miễn dịch và nhóm tiêm CY gây suy giảm miễn dịch
Lô Trọng lượng ban đầu (po) g Trọng lượng trong 5 ngày thí nghiệm (p1)g Tỉ lệ p1/po(%) I 23,36 ±1,21 25,63 ± 0,57 109,72 II 23,50 ±1,20 21,16 ± 0,7 * 90,04 III 23,83 ± 0,98 22,7 ± 0,96 * 95,88
Kết quả cho thấy trọng lượng của lô II, III giảm so với lô đối chứng sinh học (p<0.05). Trọng lượng của lô III cao hơn lô II nhưng sự khác nhau này không rõ rệt.
Bảng 3.7. Trọng lượng tương đối của tuyến ức, lách, hàm lượng hemoglobin(Hb), số lượng hồng cầu (HC), bạch cầu (BC)
Lô
Trọng lượng tương đối
Hb(g%) HC(triệu) BC Tuyến ức Lách
I 2,32±0,24 3,72±0,25 15,58±0,50 7,33±0,33 6765 ± 45
II 1,23±0,23 3,31±0,13 14,90±0,58 7,13±0,26 5859 ± 86
III 1,46±0,15 3,37±0,24 15,38±0,56 7,41±0,35 7720 ± 47*
*p<0,05 Sự khác nhau có ý nghĩa giữa nhóm gây suy giảm miễn dịch điều trị polisaccarit và nhóm suy giảm miễn dịch không điều trị polisaccarit
Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy trọng lượng tương đối ở tuyến ức giảm rõ rệt ở lô II (chuột gây tổn thương chức năng miễn dịch) so với lô I (chuột khỏe mạnh, bình thường), trọng lượng tương đối của tuyến ức, hàm lượng Hb và số lượng HC tăng ở lô III (chuột gây tổn thương chức năng miễn dịch được điều trị bằng polisaccarit tinh sạch từ lá Xuân Hoa so với lô II không được điều trị), tuy nhiên khi so sánh (p>0.05), vì vậy chưa có sự thay đổi rõ rệt.
Số lượng bạch cầu giảm mạnh ở lô II (5859) so với lô I (6765). Ở lô III, số lượng bạch cầu tăng rõ rệt (7720) so với lô II (5859) khi so sánh p<0.05. Điều đó chứng tỏ chế phẩm polisaccarit tinh sạch từ lá Xuân Hoa đã giúp cho
cơ thể chuột phản ứng tạo bạch cầu chống lại chất cyclophosphamide (chất gây tổn thương hệ miễn dịch của chuột).
Qua các thí nghiệm trên chúng tôi nhận thấy polisaccarit tinh sạch từ lá cây Xuân Hoa P. Palatiferum có tác dụng tăng bạch cầu rõ rệt nhất, điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan do một số tác giả đã khảo sát (Trần Công Khánh,1997).
Các kết quả thu được phần nào cũng phù hợp với kết quả của nghiên cứu trước đây về khả năng tăng cường miễn dịch của polisaccarit khi thử nghiệm trên chuột: polisaccarit dương quy di thực ở nhật bản có dụng phục hồi một số tổn thương cấu trúc và chức năng đáp ứng miễn dịch tế bào trên chuột xử lí cyclophosphamide (Nguyễn Gia Chấn,1997 và Sakurai,1996), các furanose chiết tách từ P. quiquefolium và pectin từ Buplerum falcatum và Malus (apple) spp đã tăng khả năng miễn dịch trong các chuột khỏe mạnh (Biondo, 2008).
Các kết quả nghiên cứu trong luận văn cho thấy hàm lượng polisaccarit trong lá cây Xuân Hoa khá cao và có giá trị sử dụng làm nguyên liệu thuốc. Các nghiên cứu của chúng tôi mới chỉ là các số liệu ban đầu đánh giá một số tác dụng sinh học của polisaccarit tinh sạch được từ cây thuốc Xuân Hoa.
Cần nhiều thời gian, kinh phí và công sức để phát hiện các tác dụng sinh học khác của polisaccarit từ cây thuốc quý này.
PHẦN IV
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận
- Đã tối ưu được các điều kiện chiết rút polisaccarit: dung môi ethanol 25%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1g/10ml) nhiệt độ chiết rút 70°C, thời gian chiết rút 12 giờ. Hàm lượng polisaccarit từ lá cây Hoa khá cao (8,2 (± 0,65) %), là nguồn polisaccarit giá trị cho các nguyên liệu thuốc.
- Xây dựng được quy trình tách chiết và tinh sạch hoàn toàn polisaccarit trong lá cây Xuân Hoa có độ sạch khoảng (97 ±2,1%), chế phẩm polisaccarit tinh sạch đạt hiệu suất (0,7 ± 0,13 %/g nguyên liệu khô).
- Đã nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa của polisaccarit tinh sạch: trọng lượng phân tử: 2321g/mol; độ nhớt tuyệt đối: 0,0122; chế phẩm polisaccarit tinh sạch rất bền và không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ; ở pH acid và kiềm chất lượng polisaccarit của chế phẩm bị giảm khoảng (15 đến 35%).
- Xác định được một số tác dụng sinh học của polisaccarit tinh sạch: nồng độ 10µg/ml ức chế một phần sự giải phóng của IL-6 trên in vitro; nồng độ 100µg/ml có khả năng hàn gắn vết thương trên tế bào nguyên sợi da người. Chế phẩm polisaccarit có khả năng phục hồi một số chức năng của các cơ quan tuyến ức, lách và làm tăng số lượng bạch cầu khi chuột tiêm cyclophosphamide (CY) in vivo.
4.2. Đề nghị
Kết quả nghiên cứu của luận văn là những kết quả đầu tiên đánh giá tác dụng kháng viêm, tăng cường miễn dịch và hàn gắn vết thương của polisaccarit tinh sạch từ lá cây Xuân Hoa P. Palatiferum. Tuy nhiên cần có nhiều thời gian hơn nữa để đánh giá một cách toàn diện hơn về các tác dụng sinh học trên của polisaccarit từ cây thuốc quý này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Võ Hoài Bắc và Lê Thị Lan Oanh. Hàm lượng acid amin và nguyên tố khoáng trong lá cây Xuân Hoa. Tạp chí dược liệu tập 8, số 1/2003, tr 11 – 15.
2. Nguyễn Gia Chấn, Lê Minh Phương, Bùi Thị Bằng, Phan Thị Phi Phi, Phạm Thu Anh, Đỗ Hòa Bình. Tác dụng phục hồi miễn dịch của polisaccarit chiết xuất từ rễ củ cây đương quy. Tạp chí Dược liệu. Tập 3, số 2/1998, tr 49-52. 3. Nguyễn Gia Chấn, Thái Thanh Hải, Nguyễn Thị Thanh Hương, Bùi Thị Bằng.
Đặc điểm sinh hóa của cây dương quy Nhật Bản, trồng tại Thái Nguyên. Tạp chí dược liệu. Tập 2 số 4/1997, tr 18-22.
4. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Trường- Thực hành hóa sinh học. Nxb Giáo dục, 1997.
5. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng- Hóa sinh học. Nxb Giáo dục, 1997. 6. Phan Minh Giang, Hà Việt Bảo, Phan Tống Sơn, “Phytochemical study on
Pseuderanthemum palatiferum (Ness)Radlk., Acanthaceae”, Tạp chí Hóa học 2003,41 (2), tr 115-118.
7. Phan Minh Giang, Hà Việt Bảo, Phan Tống Sơn. Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá và khảo sát sơ bộ tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các phần chiết giàu flavonoid từ lá Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.), Tạp chí Dược học 2005, 45 (9), tr 9-12.
8. Phạm Hoàng Hộ, “Cây cỏ Việt Nam”, NXB. Trẻ, Tp. Hồ Chí Minh 2000, tr 67. 9. Nguyễn Văn Hùng, Lê Anh Tuấn, Nguyễn Quyết Chiến, “Nghiên cứu thành
phần hóa học cây Xuân Hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk”,
Tạp chí Khoa học và Công nghệ 2004; 2, tr 75-79.
10. Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Thị Thanh Nhài và Lê Mai Hương. Góp phần nghiên cứu về thực vât, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xuân Hoa. Tạp chí Dược liệu 1998, tập 3, tr 37- 41.
11.Trần Công Khánh. Sự thật về cây thuốc "kỳ diệu", cây Xuân Hoa. Tạp chí thuốc và sức khỏe, số 101/1997, tr 10 - 11.
12.Trần Kim Thu Liễu, Nguyễn Kim Phi Phụng, “Contribution to the study on chemical constituents of palatiferum (Nees) Radlk. (Acanthaceae)”, Tuyển tập các công trình Hội nghị Khoa học về Công nghệ Hóa học Hữu cơ Toàn quốc lần thứ tư, NXB. Đại học Quốc gia Hà Nội 2007, tr 426-429.
13. Xuân Lục, “Cây thuốc diệu kỳ, Tu lình, cây thuốc nhiều tên nhiều tác dụng”, Tạp chí về dược liệu và sức khỏe cộng đồng 2005; 2, tr 22-23.
14. Lê Thị Lan Oanh, Võ Hoài Bắc, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Thị Dung, Hoa Thị Hằng, Trần Thị Thơm. Khảo sát một số chỉ tiêu sinh hóa và tác dụng thủy phân protein của lá cây Xuân hoa, Pseuderanthemum palatiferum (Nees).Tạp chí Dược liệu 1999, 4 (1), tr 13-17.
15. Lê xuân Thám, Trần hữu Độ. Bổ sung vào nhóm nấm chống ung thư Việt nam: Nấm Chân Chim. Tạp chí dược học. Số 8/1999, tr 10-12.
16. Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng,“ Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa”, Tạp chí Dược Liệu