2.2.1. Phương pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch tật lê
Để lựa chọn dung môi chiết phù hợp nhất, mẫu Bạch tật lê (2 kg) đƣợc xay thành bột mịn và ngâm chiết với các dung môi khác nhau methanol, ethanol 95%, 50% và nƣớc. Chiết mẫu bằng cách ngâm chiết ở điều kiện thƣờng, đun hồi lƣu trong 2 giờ và ngâm chiết kết hợp siêu âm với thời gian ngâm chiết khác nhau. Sau đó hỗn hợp đƣợc lọc qua giấy lọc và máy cô quay để thu cặn ethanol, methanol, nƣớc khô. Mẫu đƣợc chiết lần lƣợt 4 lần. Dịch chiết của các lần chiết đƣợc cất loại dung môi để cân so sánh khối lƣợng cao chiết thu đƣợc. Ký hiệu là cao chiết A.
2.2.2. Phương pháp lựa chọn phương pháp chiết (kiểu chiết), nhiệt độ, thời gian chiết tổng Bạch tật lê
Từ lƣợng Bạch tật lê tổng số ban đầu (2kg) đƣợc chiết bằng các phƣơng pháp đun hồi lƣu (~95ºC trong 2h), ngâm cách thuỷ 80ºC trong 2h, siêu âm (40ºC trong 0,5 giờ) và ngâm chiết (nhiệt độ thƣờng trong 24h). Thu lấy cao chiết tiến hành cân khối lƣợng và so sánh hiệu suất của từng phƣơng pháp.
Với phƣơng pháp đã đƣợc lựa chọn, thời gian chiết và nhiệt độ chiết đƣợc tối ƣu bằng cách chiết trong các nhiệt độ (95ºC, 80o
C và 60oC) và thời gian (2h, 3h và 4h). Cân và so sánh lƣợng cao chiết thu đƣợc để tìm ra điều kiện tối ƣu cho phƣơng pháp chiết.
2.2.3. Phương pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch tật lê
Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi chiết tổng và thu đƣợc cao chiết tổng, cao chiết này đƣợc chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để
loại bỏ các thành phần hoá học không mong muốn, làm giàu thành phần protodioscin. Cao chiết A đƣợc hoà lại vào 3 lít nƣớc sau đó chiết bằng dung môi ethyl acetate (1lít x 3lần). Tách loại lớp dung môi hữu cơ, dịch nƣớc đƣợc cô quay còn 2L để loại bỏ dung môi hữu cơ tồn dƣ thu đƣợc dịch B.
2.2.4. Phương pháp tách sắc ký làm giàu protodioscin
Lọc dịch B còn lại qua cột diaion HP20. Rửa giải bằng các hệ dung môi nƣớc, dung môi cồn 80%. Gom dịch rửa giải cồn 80% và cất loại dung môi thu đƣợc cao C.
Tách phân đoạn cao chiết C thu đƣợc trên cột sắc ký với chất hấp phụ silica gel pha thƣờng, tỷ lệ cao chiết/chất hấp phụ = 1/5 theo khối lƣợng, cột nhồi 10cm) và dung môi rửa giải lần lƣợt là ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol 50:1, ethyl acetate:ethanol 10:1 và ethanol 95%. Dịch rửa giải từ hệ ethyl acetate:ethanol 10:1 đƣợc gom lại, cất loại hết dung môi đến khô thu đƣợc cao D.
Hàm lƣợng protodioscin trong cao chiết D thu đƣợc đƣợc kiểm tra độ sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Điều kiện phân tích HPLC: Máy sắc ký Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems. Cột sắc ký: Cột Zorbax Eclipse XDB C18 (250 x 4.6 mm, 5μm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent. Pha động gradient 2% acetonitrile trong nƣớc trong 20 phút với tốc độ dòng: 0.5 ml/phút. Thể tích bơm mẫu 5μl, nhiệt độ cột 30ºC. Đầu dò DAD bƣớc sóng phân tích 210 nm.
2.2.5. Phương pháp dựng đường chuẩn định lượng protodioscin
Đƣờng chuẩn định lƣợng có dạng y = ax + b đƣợc xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa diện tích pic UV đƣợc chọn (y) và nồng độ tƣơng ứng của chất chuẩn (x). Đƣờng chuẩn định lƣợng thu đƣợc đạt độ tuyến tính cao với hệ số tƣơng quan R2
≥ 0,999 đối với phƣơng pháp định lƣợng bằng DAD.
Chất chuẩn Phƣơng trình đƣờng chuẩn Hệ số tƣơng quan
Hình 2.2. Đƣờng chuẩn định lƣợng chất chuẩn protodioscin
2.2.6. Phương pháp thử nghiệm sự thay đổi hormon sinh dục trên chuột
40 chuột nhắt trắng đực trƣởng thành đƣợc chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm: nhóm I là nhóm chứng (10 chuột); nhóm II, III, nhóm IV là nhóm đƣợc sử dụng tinh chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê với liều lần lƣợt là 2,5mg/kg (10 chuột); 5,0mg/kg (10 chuột) và 10 mg/kg (10 chuột) cân nặng.
Điều trị bằng sử dụng dịch chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê cho chuột nhóm II, III, IV: cho sử dụng dịch chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê 1 lần/ngày với liều lƣợng lần lƣợt là 2,5 mg/kg; 5,0mg/kg và 10 mg/kg cân nặng trong 4 tuần.
Một ngày sau khi sử dụng liều cuối cùng thì chuột đƣợc lấy máu định lƣợng nồng độ các hormon testosterone, gonadotropin (FSH và LH). Xét nghiệm định lƣợng nồng độ hormon testosterone, gonadotropin (FSH, LH) bằng phƣơng pháp elisa sử dụng qui trình xét nghiệm và máy xét nghiệm QTXN.MD.002/003/007 V 1,0 Cobas6000 tại bệnh viện phụ sản Trung ƣơng. So sánh nồng độ hormon sinh dục ở nhóm chứng và nhóm điều trị.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các dữ liệu đƣợc phân tích bằng phần mềm Microsoft excel và phần mềm STATA, kiểm định giá trị trung bình. Xác định hàm lƣợng và các tính chất lý hóa của sản phẩm, tiến hành lặp lại 3 lần.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lựa chọn dung môi và điều kiện chiết tổng Bạch tật lê
Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải đƣợc lựa chọn rất cẩn thận. Điều kiện của dung môi là phải hòa tan đƣợc chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng đƣợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy. Chloroform, metylen clorid và methanol là những dung môi thƣờng đƣợc lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây nhƣ: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa… Những tạp chất của chloroform nhƣ CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất nhƣ các alkaloid tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tƣơng tự nhƣ vậy, sự có mặt của lƣợng nhỏ axit clohydric (HCl) cũng có thể gây ra sự phân hủy, sự khử hay sự đồng phân hóa các hợp chất khác.
Methanol và ethanol là những dung môi phân cực hơn các hydrocarbon clo hóa. Ngƣời ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu đƣợc lƣợng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của chloroform thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancohol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancohol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời. Thông thƣờng dung môi cồn trong nƣớc có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng các dung môi: methanol, ethanol 95%, ethanol 50% và nƣớc để chiết mẫu Bạch tật lê.
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết theo các dung môi chiết khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên liệu, đun hồi lƣu ở 950C trong 2h)
Dung môi Ethanol 50% Ethanol 95% Methanol Nƣớc
Chiết lần 1 (g) 139,1 127,2 132,5 134,6 Chiết lần 2 (g) 55,8 51,4 48,3 55,1 Chiết lần 3 (g) 12,4 10,5 9,4 11,2 Chiết lần 4 (g) 2,92 2,3 1,5 4,1 Tổng 210,22 (10,5%) 191,4 (9,57%) 191,7 (9,58%) 205 (10,25%)
Qua kết quả ở bảng 3.1 ta thấy: Trong số các dung môi methanol, ethanol 50%, 95% và nƣớc đƣợc sử dụng để chiết mẫu Bạch tật lê. Methanol vừa có hiệu suất chiết thấp (9,58%) vừa là dung môi độc nên không phù hợp. Chiết bằng nƣớc có ƣu điểm rẻ tiền, an toàn và có hiệu suất khá cao, tuy nhiên dịch chiết có độ nhớt cao, nhiều bọt nên khó cho các bƣớc xử lý tiếp theo. Dung môi ethanol 50% cho hiệu suất chiết tốt nhất đạt 10,5%, lƣợng dịch chiết nhiều hơn các dung môi còn lại đồng thời dịch chiết ít nhớt, dễ xử lý cho công đoạn tiếp theo. Chính vì vậy, ở các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sử dụng dung môi ethanol 50%.
Kết quả này tƣơng đƣơng với nghiên cứu của Ghosh và cộng sự (2012) cây Bạch tật lê khô cũng đƣợc chiết bởi các dung môi ethanol 30%, 50%, 70%, 100%, methanol và nƣớc. Trong đó, chiết bằng ethanol 50% cho khả năng hòa tan các saponin trong Bạch tật lê là tốt nhất [23]
3.2. Lựa chọn phƣơng pháp, nhiệt độ chiết tổng Bạch tật lê
Từ kết quả ở phần 3.1, chúng tôi đã nghiên cứu các phƣơng pháp chiết khác nhau với dung môi ethanol 50% ở các nhiệt độ khác nhau và đánh giá hiệu suất chiết.
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy: Chiết bằng cách siêu âm, đun hồi lƣu và ngâm chiết ở nhiệt độ thƣờng cho thấy hai phƣơng pháp siêu âm, đun hồi lƣu cho hiệu suất chiết giống nhau (10,4-10,5%), ngâm chiết ở nhiệt độ thƣờng có hiệu suất chiết thấp hơn (8,85%), trong khi chiết bằng ngâm cách thuỷ ở 80ºC cho hiệu suất thấp nhất (7,63%). Ngâm chiết ở nhiệt độ thƣờng có ƣu điểm đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn năng lƣợng gia nhiệt, tuy nhiên hiệu suất chiết không cao và tốn thời gian. Chiết bằng siêu âm có ƣu điểm nhanh tiết kiệm đƣợc thời gian nhƣng phải sử dụng bể siêu âm, tốn điện năng, khó kiểm soát nhiệt độ chiết, chi phí cao nếu áp dụng ở quy mô lớn. Đun hồi lƣu ở nhiệt độ sôi của hỗn hợp dung môi đơn giản dễ thực hiện, có thể áp dụng ở quy mô lớn. Trong khi đó nghiên cứu của Sarvin và cộng sự (2017) cũng chỉ ra rằng đun hồi lƣu ở 950c cho kết quả thu đƣợc protodioscin từ Bạch tật lê là cao nhất khi so sánh với các phƣơng pháp chiết khác nhau để thu hồi protodioscin bao gồm siêu âm, đun hồi lƣu, đun hồi lƣu với áp lực thấp và chiết thông thƣờng [45].
3.2.2. Lựa chọn nhiệt độ chiết suất Protodioscin từ cây Bạch tật lê:
Bảng 3.2. Hiệu suất chiết theo các phƣơng pháp chiết khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên liệu)
Dung môi
Ethanol 50% Đun hồi lƣu
(~95ºC, 2h) Ngâm cách thuỷ (80ºC, 2h) Siêu âm (40ºC, 0,5h) Ngâm chiết (nhiệt độ thƣờng, 24h) Chiết lần 1 (g) 139,1 48,3 140,3 121,4 Chiết lần 2 (g) 55,8 52,4 54,5 45,2 Chiết lần 3 (g) 12,4 37,8 11,8 9,2 Chiết lần 4 (g) 2,92 13,3 1,49 1,1 Tổng 210,22 (10,5%) 152,7 (7,63%) 208,09 (10,4%) 176,9 (8,85%)
Thử nghiệm các điều kiện chiết xuất ở nhiệt độ khác nhau cho thấy mẫu đƣợc đun hồi lƣu trong 2h có hiệu suất chiết cao nhất. Khi giảm nhiệt độ chiết xuống 80ºC và tăng thời gian ngâm chiết lên 3h hoặc ngâm ở 60ºC trong 4h cho hiệu suất thấp hơn rất nhiều (7,63% và 6,07%).
Bảng 3.3. Hiệu suất chiết theo các nhiệt độ chiết khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên liệu)
Dung môi
Ethanol 50% Đun hồi lƣu
(~95ºC, 2h) Ngâm chiết (80ºC, 3h) Ngâm chiết (60ºC, 4h) Ngâm chiết (nhiệt độ thƣờng, 24h) Chiết lần 1 (g) 139,1 48,3 32,7 121,4 Chiết lần 2 (g) 55,8 52,4 45,5 45,2 Chiết lần 3 (g) 12,4 37,8 32,8 9,2 Chiết lần 4 (g) 2,92 13,3 10,4 1,1 Tổng 210,22 (10,5%) 152,7 (7,63%) 121,4 (6,07%) 176,9 (8,85%)
3.3. Lựa chọn thời gian chiết suất Protodioscin từ cây Bạch tật lê
Thời gian chiết đƣợc thử nghiệm với các điều kiện ethanol 50%, đun hồi lƣu nhƣ xác định ở trên. Các thời gian đƣợc thử nghiệm gồm đun hồi lƣu trong 1 giờ; 1,5 giờ; 2 giờ; 2,5 giờ và 3 giờ. Kết quả cho thấy thời gian đun hồi lƣu trong 2h cho hiệu suất chiết tối ƣu nhất. Mặc dù thời gian đun lâu hơn (2,5 và 3 giờ) cho hiệu suất chiết cao hơn nhƣng về mặt kinh tế lại không tối ƣu do lƣợng cao chiết thu đƣợc tăng lên không đáng kể mà thời gian chiết kéo quá dài.
Bảng 3.4. Hiệu suất chiết theo thời gian chiết khác nhau
(g cao chiết/2 kg nguyên liệu, đun hồi lƣu ở 950C trong 2 h với ethanol 50%)
Dung môi 1 giờ 1,5 giờ 2 giờ 2,5 giờ 3 giờ
Chiết lần 1 (g) 107,2 128,6 139,1 142,7 145,1 Chiết lần 2 (g) 62,3 54,1 55,8 56,9 59,3 Chiết lần 3 (g) 17,9 12,5 12,4 10,3 9,4 Chiết lần 4 (g) 3,4 2,0 2,92 2,8 5,1 Tổng 190,8 (9,54%) 197,2 (9,86%) 210,22 (10,5%) 212,7 (10,6%) 218,9 (10,9)
Số lần chiết đƣợc thực hiện thử nghiệm 4 lần, lƣợng dịch chiết sau mỗi lần chiết đƣợc cân chính xác để so sánh. Kết quả cho thấy sau 3 lần chiết là đủ để chiết hết hoạt chất.
Kết quả so sánh tổng hợp đƣợc mô tả trong bảng sau (nguyên liệu 2kg bột Bạch tật lê khô):
Bảng 3.5. Hiệu suất chiết theo các điều kiện khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên liệu)
Dung môi Ethanol 50% Ethanol 95% Methanol Nƣớc Đun hồi lƣu ở 950C trong 2h Siêu âm ở 400 C trong 0,5h Ngâm chiết ở nhiệt độ thƣờng trong 24h Đun hồi lƣu ở 950 C trong 2h Đun hồi lƣu ở 950C trong 2h Đun hồi lƣu ở 950C trong 2h Chiết lần 1 (g) 139,1 140,3 121,4 127,2 132,5 134,6 Chiết lần 2 (g) 55,8 54,5 45,2 51,4 48,3 55,1 Chiết lần 3 (g) 12,4 11,8 9,2 10,5 9,4 11,2 Chiết lần 4 (g) 2,92 1,49 1,1 2,3 1,5 4,1 Tổng 210,22 208,09 176,9 191,4 191,7 205
Từ các kết quả trên cho thấy chiết bằng dung môi ethanol 50% bằng phƣơng pháp đun hồi lƣu ở 950C trong thời gian 2h, lặp lại 3 lần cho hiệu suất chiết tối ƣu nhất. Áp dụng điều kiện này để chiết xuất Protodioscin từ cây Bạch tật lê, gom các dịch chiết lại, cất loại dung môi thu đƣợc cao chiết saponin steroid giàu protodioscin từ cây Bạch tật lê (Cao chiết A).
Trong nghiên cứu của Ghosh và cộng sự (2012) phƣơng pháp đun hồi lƣu ở 950C trong 2 giờ với dung môi ethanol 50% cũng đƣợc các tác giả áp dụng [23] chứng tỏ điều kiện chiết suất nhƣ chúng tôi áp dụng là có hiệu quả tối ƣu nhất trong các điều kiện chiết đƣợc thiết lập.
3.4. Nghiên cứu chiết phân đoạn dịch chiết tổng Protodioscin từ cây Bạch tật lê:
Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi chiết tổng và thu đƣợc cao chiết A, cao chiết này đƣợc chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để loại bỏ các thành phần hoá học không mong muốn, làm giàu thành phần protodioscin. Hợp chất này là saponin nhiều glycoside có độ phân cực cao do đó việc tách loại nhóm chất kém phân cực nhƣ dầu béo, sáp và nhóm chất phân cực trung bình (saponin, flavonoid, terpenoid...) sẽ góp phần làm giàu hoạt chất.
Cao chiết ethanol 50% thu đƣợc đƣợc ở trên đƣợc phân bố lại vào nƣớc sau đó chiết loại nhóm chất kém phân cực bằng dung môi ethyl acetate. Dịch nƣớc còn lại sau khi chiết đƣợc gom lại, cất quay chân không sơ bộ để loại hết dung môi ethyl acetate còn dƣ thu đƣợc dịch chiết B.
Hình 3.1: Sắc ký bản mỏng mẫu cao chiết tổng và phân đoạn: (1) cao A, (2) cao chiết ethyl acetate, (3) dịch chiết B. Bản mỏng silica gel pha thƣờng, dung môi triển khai dichloromethane-methanol 1:1
Hình 3.2: Sắc ký bản mỏng mẫu cao B (1), cao C (2). Bản mỏng silica gel pha thƣờng, dung môi triển khai ethyl acetate:ethanol 20:1
3.5. Nghiên cứu tách sắc ký làm giàu protodioscin
Dịch chiết B chứa protodioscin đƣợc lọc qua cột sắc ký diaion HP20, rửa giải cột bằng nƣớc cất nhằm loại tạp gồm các muối vô cơ, muối hữu cơ, đƣờng tự do.... Sau đó rửa giải cột bằng hệ dung môi ethanol 80%. Gom dịch rửa giải ethanol 80% và cất loại dung môi thu đƣợc 18,5g cao chiết C.
Cao chiết C đƣợc phân tách tiếp trên cột sắc ký silica gel pha thƣờng, rửa giải lần lƣợt bằng hệ dung môi ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol (50:1), ethyl acetate:ethanol (10:1) và ethanol 95%. Gom các dịch rửa giải phân đoạn ethyl acetate:ethanol (10:1) cất loại dung môi thu đƣợc 1,4g cao chiết D chứa protodioscin.
Hàm lƣợng protodioscin trong cao chiết D thu đƣợc ở trên đƣợc kiểm tra độ sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Kết quả cho thấy hàm lƣợng
protodioscin đạt 40,6%. Các kết quả phân tích sắc ký đƣợc thể hiện ở các hình 3.3- 3.6.
Hình 3.3. Sắc ký đồ của chất chuẩn protodioscin bƣớc sóng 210nm
Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu Bạch tật lê thân lá bƣớc sóng 210nm
Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của cao D chứa protodioscin bƣớc sóng 210nm
Từ các kết quả trên, chúng tôi đã xác định đƣợc hàm lƣợng protodioscin từ cây Bạch tật lê.
3.6. Xây dựng qui trình tách chiết protodioscin qui mô phòng thí nghiệm
Từ các kết quả thu đƣợc ở trên, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất làm giàu protodioscin qui mô phòng thí nghiệm theo sơ đồ sau:
Thuyết minh qui trình:
Bƣớc 1: Phần lá cành Bạch tật lê đƣợc sơ chế và phơi khô trong bóng râm sau đó xay thành bột mịn.
Bƣớc 2: Đun hồi lƣu ở 950
C 2 kg mẫu nguyên liệu bột khô này bằng 4 lít ethanol 50% trong 2h. Dịch chiết đƣợc rút kiệt ra rồi bổ sung 3 lít ethanol 50% vào và chiết tiếp. Sau 3 lần ngâm chiết nhƣ vậy, các dịch chiết đƣợc gom lại, lọc và cất loại dung