CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Lựa chọn phƣơng pháp, nhiệt độ chiết tổng Bạch Tật Lê
Từ kết quả ở phần 3.1, chúng tôi đã nghiên cứu các phƣơng pháp chiết khác nhau với dung môi ethanol 50% ở các nhiệt độ khác nhau và đánh giá hiệu suất chiết.
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy: Chiết bằng cách siêu âm, đun hồi lƣu và ngâm chiết ở nhiệt độ thƣờng cho thấy hai phƣơng pháp siêu âm, đun hồi lƣu cho hiệu suất chiết giống nhau (10,4-10,5%), ngâm chiết ở nhiệt độ thƣờng có hiệu suất chiết thấp hơn (8,85%), trong khi chiết bằng ngâm cách thuỷ ở 80ºC cho hiệu suất thấp nhất (7,63%). Ngâm chiết ở nhiệt độ thƣờng có ƣu điểm đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn năng lƣợng gia nhiệt, tuy nhiên hiệu suất chiết không cao và tốn thời gian. Chiết bằng siêu âm có ƣu điểm nhanh tiết kiệm đƣợc thời gian nhƣng phải sử dụng bể siêu âm, tốn điện năng, khó kiểm soát nhiệt độ chiết, chi phí cao nếu áp dụng ở quy mô lớn. Đun hồi lƣu ở nhiệt độ sôi của hỗn hợp dung môi đơn giản dễ thực hiện, có thể áp dụng ở quy mô lớn. Trong khi đó nghiên cứu của Sarvin và cộng sự (2017) cũng chỉ ra rằng đun hồi lƣu ở 950c cho kết quả thu đƣợc protodioscin từ Bạch tật lê là cao nhất khi so sánh với các phƣơng pháp chiết khác nhau để thu hồi protodioscin bao gồm siêu âm, đun hồi lƣu, đun hồi lƣu với áp lực thấp và chiết thông thƣờng [45].
3.2.2. Lựa chọn nhiệt độ chiết suất Protodioscin từ cây Bạch tật lê:
Bảng 3.2. Hiệu suất chiết theo các phƣơng pháp chiết khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên liệu)
Dung môi
Ethanol 50% Đun hồi lƣu
(~95ºC, 2h) Ngâm cách thuỷ (80ºC, 2h) Siêu âm (40ºC, 0,5h) Ngâm chiết (nhiệt độ thƣờng, 24h) Chiết lần 1 (g) 139,1 48,3 140,3 121,4 Chiết lần 2 (g) 55,8 52,4 54,5 45,2 Chiết lần 3 (g) 12,4 37,8 11,8 9,2 Chiết lần 4 (g) 2,92 13,3 1,49 1,1 Tổng 210,22 (10,5%) 152,7 (7,63%) 208,09 (10,4%) 176,9 (8,85%)
Thử nghiệm các điều kiện chiết xuất ở nhiệt độ khác nhau cho thấy mẫu đƣợc đun hồi lƣu trong 2h có hiệu suất chiết cao nhất. Khi giảm nhiệt độ chiết xuống 80ºC và tăng thời gian ngâm chiết lên 3h hoặc ngâm ở 60ºC trong 4h cho hiệu suất thấp hơn rất nhiều (7,63% và 6,07%).
Bảng 3.3. Hiệu suất chiết theo các nhiệt độ chiết khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên liệu)
Dung môi
Ethanol 50% Đun hồi lƣu
(~95ºC, 2h) Ngâm chiết (80ºC, 3h) Ngâm chiết (60ºC, 4h) Ngâm chiết (nhiệt độ thƣờng, 24h) Chiết lần 1 (g) 139,1 48,3 32,7 121,4 Chiết lần 2 (g) 55,8 52,4 45,5 45,2 Chiết lần 3 (g) 12,4 37,8 32,8 9,2 Chiết lần 4 (g) 2,92 13,3 10,4 1,1 Tổng 210,22 (10,5%) 152,7 (7,63%) 121,4 (6,07%) 176,9 (8,85%)
3.3. Lựa chọn thời gian chiết suất Protodioscin từ cây Bạch tật lê
Thời gian chiết đƣợc thử nghiệm với các điều kiện ethanol 50%, đun hồi lƣu nhƣ xác định ở trên. Các thời gian đƣợc thử nghiệm gồm đun hồi lƣu trong 1 giờ; 1,5 giờ; 2 giờ; 2,5 giờ và 3 giờ. Kết quả cho thấy thời gian đun hồi lƣu trong 2h cho hiệu suất chiết tối ƣu nhất. Mặc dù thời gian đun lâu hơn (2,5 và 3 giờ) cho hiệu suất chiết cao hơn nhƣng về mặt kinh tế lại không tối ƣu do lƣợng cao chiết thu đƣợc tăng lên không đáng kể mà thời gian chiết kéo quá dài.
Bảng 3.4. Hiệu suất chiết theo thời gian chiết khác nhau
(g cao chiết/2 kg nguyên liệu, đun hồi lƣu ở 950C trong 2 h với ethanol 50%)
Dung môi 1 giờ 1,5 giờ 2 giờ 2,5 giờ 3 giờ
Chiết lần 1 (g) 107,2 128,6 139,1 142,7 145,1 Chiết lần 2 (g) 62,3 54,1 55,8 56,9 59,3 Chiết lần 3 (g) 17,9 12,5 12,4 10,3 9,4 Chiết lần 4 (g) 3,4 2,0 2,92 2,8 5,1 Tổng 190,8 (9,54%) 197,2 (9,86%) 210,22 (10,5%) 212,7 (10,6%) 218,9 (10,9)
Số lần chiết đƣợc thực hiện thử nghiệm 4 lần, lƣợng dịch chiết sau mỗi lần chiết đƣợc cân chính xác để so sánh. Kết quả cho thấy sau 3 lần chiết là đủ để chiết hết hoạt chất.
Kết quả so sánh tổng hợp đƣợc mô tả trong bảng sau (nguyên liệu 2kg bột Bạch tật lê khô):
Bảng 3.5. Hiệu suất chiết theo các điều kiện khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên liệu)
Dung môi Ethanol 50% Ethanol 95% Methanol Nƣớc Đun hồi lƣu ở 950C trong 2h Siêu âm ở 400 C trong 0,5h Ngâm chiết ở nhiệt độ thƣờng trong 24h Đun hồi lƣu ở 950 C trong 2h Đun hồi lƣu ở 950C trong 2h Đun hồi lƣu ở 950C trong 2h Chiết lần 1 (g) 139,1 140,3 121,4 127,2 132,5 134,6 Chiết lần 2 (g) 55,8 54,5 45,2 51,4 48,3 55,1 Chiết lần 3 (g) 12,4 11,8 9,2 10,5 9,4 11,2 Chiết lần 4 (g) 2,92 1,49 1,1 2,3 1,5 4,1 Tổng 210,22 208,09 176,9 191,4 191,7 205
Từ các kết quả trên cho thấy chiết bằng dung môi ethanol 50% bằng phƣơng pháp đun hồi lƣu ở 950C trong thời gian 2h, lặp lại 3 lần cho hiệu suất chiết tối ƣu nhất. Áp dụng điều kiện này để chiết xuất Protodioscin từ cây Bạch tật lê, gom các dịch chiết lại, cất loại dung môi thu đƣợc cao chiết saponin steroid giàu protodioscin từ cây Bạch tật lê (Cao chiết A).
Trong nghiên cứu của Ghosh và cộng sự (2012) phƣơng pháp đun hồi lƣu ở 950C trong 2 giờ với dung môi ethanol 50% cũng đƣợc các tác giả áp dụng [23] chứng tỏ điều kiện chiết suất nhƣ chúng tôi áp dụng là có hiệu quả tối ƣu nhất trong các điều kiện chiết đƣợc thiết lập.
3.4. Nghiên cứu chiết phân đoạn dịch chiết tổng Protodioscin từ cây Bạch tật lê:
Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi chiết tổng và thu đƣợc cao chiết A, cao chiết này đƣợc chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để loại bỏ các thành phần hoá học không mong muốn, làm giàu thành phần protodioscin. Hợp chất này là saponin nhiều glycoside có độ phân cực cao do đó việc tách loại nhóm chất kém phân cực nhƣ dầu béo, sáp và nhóm chất phân cực trung bình (saponin, flavonoid, terpenoid...) sẽ góp phần làm giàu hoạt chất.
Cao chiết ethanol 50% thu đƣợc đƣợc ở trên đƣợc phân bố lại vào nƣớc sau đó chiết loại nhóm chất kém phân cực bằng dung môi ethyl acetate. Dịch nƣớc còn lại sau khi chiết đƣợc gom lại, cất quay chân không sơ bộ để loại hết dung môi ethyl acetate còn dƣ thu đƣợc dịch chiết B.
Hình 3.1: Sắc ký bản mỏng mẫu cao chiết tổng và phân đoạn: (1) cao A, (2) cao chiết ethyl acetate, (3) dịch chiết B. Bản mỏng silica gel pha thƣờng, dung môi triển khai dichloromethane-methanol 1:1
Hình 3.2: Sắc ký bản mỏng mẫu cao B (1), cao C (2). Bản mỏng silica gel pha thƣờng, dung môi triển khai ethyl acetate:ethanol 20:1
3.5. Nghiên cứu tách sắc ký làm giàu protodioscin
Dịch chiết B chứa protodioscin đƣợc lọc qua cột sắc ký diaion HP20, rửa giải cột bằng nƣớc cất nhằm loại tạp gồm các muối vô cơ, muối hữu cơ, đƣờng tự do.... Sau đó rửa giải cột bằng hệ dung môi ethanol 80%. Gom dịch rửa giải ethanol 80% và cất loại dung môi thu đƣợc 18,5g cao chiết C.
Cao chiết C đƣợc phân tách tiếp trên cột sắc ký silica gel pha thƣờng, rửa giải lần lƣợt bằng hệ dung môi ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol (50:1), ethyl acetate:ethanol (10:1) và ethanol 95%. Gom các dịch rửa giải phân đoạn ethyl acetate:ethanol (10:1) cất loại dung môi thu đƣợc 1,4g cao chiết D chứa protodioscin.
Hàm lƣợng protodioscin trong cao chiết D thu đƣợc ở trên đƣợc kiểm tra độ sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Kết quả cho thấy hàm lƣợng
protodioscin đạt 40,6%. Các kết quả phân tích sắc ký đƣợc thể hiện ở các hình 3.3- 3.6.
Hình 3.3. Sắc ký đồ của chất chuẩn protodioscin bƣớc sóng 210nm
Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu Bạch tật lê thân lá bƣớc sóng 210nm
Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của cao D chứa protodioscin bƣớc sóng 210nm
Từ các kết quả trên, chúng tôi đã xác định đƣợc hàm lƣợng protodioscin từ cây Bạch tật lê.
3.6. Xây dựng qui trình tách chiết protodioscin qui mô phòng thí nghiệm
Từ các kết quả thu đƣợc ở trên, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất làm giàu protodioscin qui mô phòng thí nghiệm theo sơ đồ sau:
Thuyết minh qui trình:
Bƣớc 1: Phần lá cành Bạch tật lê đƣợc sơ chế và phơi khô trong bóng râm sau đó xay thành bột mịn.
Bƣớc 2: Đun hồi lƣu ở 950
C 2 kg mẫu nguyên liệu bột khô này bằng 4 lít ethanol 50% trong 2h. Dịch chiết đƣợc rút kiệt ra rồi bổ sung 3 lít ethanol 50% vào và chiết tiếp. Sau 3 lần ngâm chiết nhƣ vậy, các dịch chiết đƣợc gom lại, lọc và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 210 g cao chiết tổng, ký hiệu là cao chiết A.
Bƣớc 3: Thêm 3 lít nƣớc vào cao chiết A và chiết phân bố bằng dung môi ethyl acetate (1lít x 3lần). Tách loại lớp dung môi hữu cơ, dịch nƣớc đƣợc cô quay còn 2 lít để loại bỏ dung môi hữu cơ tồn dƣ thu đƣợc dịch B.
Bƣớc 4: Lọc dịch B còn lại ở bƣớc 3 qua cột diaion HP20. Rửa giải bằng các hệ dung môi nƣớc, dung môi ethanol 80%. Gom dịch rửa giải ethanol 80% và cất loại dung môi thu đƣợc cao chiết C.
Bƣớc 5: Tách phân đoạn cao chiết C thu đƣợc trên cột sắc ký với chất hấp phụ silica gel pha thƣờng, tỷ lệ cao chiết/chất hấp phụ = 1/5 theo khối lƣợng, cột nhồi 10cm và dung môi giải hấp lần lƣợt là ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol (50:1), ethyl acetate:ethanol (10:1) và ethanol 95%. Dịch rửa giải từ hệ ethyl acetate:ethanol (10:1) đƣợc gom lại, cất loại hết dung môi đến khô thu đƣợc cao chiết D.
3.7. Nghiên cứu sự thay đổi hormon sinh dục của chuột khi sử dụng dịch chiết chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê: chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê:
Bảng 3.6. Nồng độ các hormon sinh dục ở chuột bình thƣờng và chuột sử dụng dịch chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê
Hormon (Đối chứng) ̅ ± SD Nhóm II ̅ ± SD Nhóm III ̅ ± SD Nhóm IV ̅ ± SD LH (IU/L) < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 FSH (IU/L) < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Testosterone (ng/ml) 1,83 ± 1,56 9,73±20,76 15,43±18,53 25,03±17,19 P21 = 0,75 P31= 0,03 P41 = 0,03
Từ kết quả ở bảng 3.8 ta thấy: nồng độ hai hormon sinh dục FSH và LH đều thấp dƣới ngƣỡng phát hiện nhỏ nhất của máy xét nghiệm (<0,1 IU/L).
Nồng độ hormon sinh dục testosterone ở chuột đƣợc cho sử dịnh dịch chiết chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê liều thấp nhất (2,5 mg/kg/ngày) và nhóm chứng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Ở hai nhóm còn lại nhóm III và nhóm IV nồng độ hormon sinh dục testosterone trong máu sau điều trị 4 tuần cao hơn ở nhóm chứng, trong đó nồng độ hormon sinh dục testosterone ở nhóm điều trị với liều lƣợng 10 mg/kg là cao nhất 25,03±17,19 mg/mL. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05.
Khi đánh giá về ảnh hƣởng của chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê lên nồng độ hormon sinh dục gonatropin của thùy trƣớc tuyến yên chúng tôi đã gặp khó khăn và không đánh giá đƣợc do nồng độ hai hormon sinh dục FSH và LH đều thấp dƣới ngƣỡng phát hiện. Lý giải kết quả này là do ở Bệnh viện Phụ Sản Trung Ƣơng sử dụng hệ thống để định lƣợng các hormon sinh dục với ngƣỡng phát hiện nhỏ nhất của FSH và LH là 0,1 IU/L. Cho tới hiện nay có rất ít nghiên cứu đánh giá về ảnh hƣởng thực sự của chiết xuất chữa protodioscin từ cây Bạch tật lê lên các hormon sinh dục này và các kết quả trong các nghiên cứu cũng rất khác nhau. Nghiên cứu của Adaay và Matta (2012) sử dụng chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê cho thấy nồng độ hormon sinh dục FSH ở nhóm chuột bình thƣờng là 1,34 ± 0,03 mIU/mL và còn ở nhóm đƣợc cho sử dụng hỗn hợp thức ăn có chứa chiết xuất chữa protodioscin từ cây Bạch tật lê là 1,98 ± 0,01 mIU/mL. Giá trị
hormon sinh dục LH ở hai nhóm lần lƣợt là 1,57 ± 0,01 mIU/mL và 2,17 ± 0,01 mIU/mL [4]. Một nghiên cứu khác của Moghaddam và cộng sự (2013) sử dụng ELISA kits (Labsystem, Finland) để định lƣợng nồng độ hormon sinh dục gonadotropin trong máu thu đƣợc kết quả ở nhóm chứng khoảng 0,3 mIU/mL, nhóm đƣợc sử dụng tinh chiết chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê là 0,271 mIU/mL, giá trị hormon sinh dục LH ở nhóm đối chứng khoảng 0,2 mIU/mL, ở nhóm dùng thuốc là 0,207 mIU/mL, ở chuột gây nghiện 0,0125 ± 0,017 mIU/mL [39]. Chứng tỏ ngƣỡng phát hiện của kit xét nghiệm có giá trị thấp hơn kit xét nghiệm của chúng tôi và bản thân ngƣỡng phát hiện của các kít xét nghiệm cũng rất khác nhau. Nhƣng xét trong điều kiện kinh phí của đề tài và điều kiện xét nghiệm tại Việt Nam chúng tôi chƣa thể sử dụng kit xét nghiệm có ngƣỡng phát hiện thấp hơn vì vậy chúng tôi hi vọng các nghiên cứu sau sẽ khắc phục đƣợc nhƣợc điểm này của chúng tôi.
Khi đánh giá ảnh hƣởng của chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê lên hormon sinh dục testosterone là hormon có vai trò quan trọng lên quá trình sinh tinh chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ trong bảng 3.8. Sau 4 tuần cho chuột sử dụng tinh chiết chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê với các liều khác nhau 2,5mg/kg; 5,0mg/kg; 10mg/kg chúng tôi thấy so với nhóm không đƣợc dùng thuốc thì ở hai nhóm dùng liều 5,0mg/kg/ngày và 10mg/kg/ngày có nồng độ hormon sinh dục testosterone cao hơn với P<0,05. Kết quả này của chúng tôi cũng tƣơng tự nhƣ nghiên cứu của Gauthaman và cộng sự (2008). Khi cho chuột sử dụng chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê với liều 5,0mg/kg và 10mg/kg thì nồng độ hormon sinh dục testosterone trong máu tăng 21% và 23% so với nhóm chuột không đƣợc sử dụng dịch chiết chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê. Trong nghiên cứu này các tác giả cũng ghi nhận không chỉ trên chuột mà ở cả linh trƣởng và thỏ chiết xuất protodioscin từ cây Bạch tật lê cũng cho kết quả tƣơng tự [40]. Có nhiều quan điểm để giải thích cho kết quả làm tăng nồng độ hormon sinh dục testosterone trong máu sau khi dùng chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê. Quan điểm cũ cho rằng chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê làm tăng hormon sinh
dục LH ở thùy trƣớc tuyến yên do vậy làm tăng nồng độ hormon sinh dục testosterone. Trong chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê có khả năng kích thích vùng dƣới đồi sản xuất hormon tăng trƣởng GnRH, sau đó GnRH tác động vào thùy trƣớc tuyến yên làm tăng sản xuất hormon sinh dục FSH và LH hoặc tác dụng trực tiếp vào các tế bào thùy trƣớc tuyến yên làm tăng sản xuất hormon sinh dục LH [20, 21]. Hormon sinh dục LH sẽ kích thích các tế bào Leydig trong mô kẽ của tinh hoàn tăng sản xuất testosterone. Hormon sinh dục FSH cũng có vai trò quan trọng trong việc duy trì nồng độ cao của hormon sinh dục testosterone tại tinh hoàn để kích thích quá trình sinh tinh thông qua tế bào Sertoli. Hormon sinh dục FSH kích thích các tế bào Sertoli làm tăng sản xuất ABP-Androgen Binding Protein. Bình thƣờng ABP có ái lực cao với testosterone do vậy testosterone sẽ đi từ mao mạch vào khoảng kẽ, qua màng đáy của ống sinh tinh để đi vào tế bào Sertoli, cuối cùng nó đi qua màng tế bào để vào lòng ống sinh tinh. Đây chính là lƣợng hormon sinh dục testosterone cần thiết để kích thích sinh tinh trùng. Nhiều nghiên cứu cho thấy để quá trình sinh tinh diễn ra một cách bình thƣờng thì nồng độ hormon môn sinh dục testosterone trong tinh hoàn phải cao hơn trong huyết tƣơng 5–10 lần. Trong nghiên cứu của chúng tôi có định lƣợng cả hormon sinh dục FSH và LH để xem tác dụng lên trục hạ đồi tuyến yên nhƣng do nhƣợc điểm của nghiên cứu chƣa thể hiện đƣợc số thực của các hormon trên nên chúng tôi chƣa đƣa ra đƣợc nhận xét về cơ chế này. Kết quả nghiên cứu của Moghaddam và cộng sự (2013), El-Tantawy (2007) là cơ sở ủng hộ cho quan điểm trên khi thấy sau khi dùng chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê thì nồng độ hormon sinh dục FSH và LH tăng cao so với nhóm không đƣợc điều trị. Một cơ chế khác đƣợc đƣa ra để giải thích tăng nồng độ hormon sinh dục testosterone đó là làm tăng quá trình tổng hợp tạo ra tiền chất liên quan đến quá trình tổng hợp hormon sinh dục