Nuôi cấy sinh khối rễ tơ

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (codonopsis sp ) trong hệ thống bioreactor (Trang 26 - 31)

Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các lông rễ được sản sinh ra mạnh mẽ tại vị trí bị nhiễm bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. T-DNA từ A. rhizogenes sau khi chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gene của thực vật, từ đó tế bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gene rol và gen aux (tổng hợp ra IAA nội sinh) làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn thương ở mô thực vật đó. Số lượng các lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ.

Với sự chuyển đổi gen của A. rhizogenes vào tế bào, rễ tơ có khả năng tổng hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các tế bào không phân hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp được hay tổng hợp với hàm lượng không đáng kể. Rễ tơ được xem như là một nguồn nguyên liệu có giá trị trong sản xuất các hợp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, chất phụ gia trong thực phẩm và mỹ phẩm (Bulgakov et al., 2003; Casanova et al., 2005). Nhờ vào những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả năng tổng hợp một số lượng lớn các hợp chất tự nhiên, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên trên quy mô công nghiệp với hiệu suất cao, giảm chi phí sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm. Những nghiên cứu về rễ tơ hiện đã và đang phát triển trong nước, cho ra những dòng rễ sinh tổng hợp

những hoạt chất phục vụ trong y học. Phạm Bích Ngọc và cs (2012) đã thành công trong việc tìm ra qui trình chuyển gen tạo rễ tơ vào cây Bá Bệnh thông qua chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834. Nhóm tác giả đã chọn vật liệu cho quá trình biến nạp là thân và lá cây mầm. Kết quả thu được tỷ lệ cảm ứng tạo rễ tơ cao nhất là 71 % và thấp nhất là 64,5 % và môi trường phù hợp cho việc nuôi cấy là WPM. Thông qua quá trình chọn lọc đã tuyển chọn được 23 dòng rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, có thể nâng cấp ứng dụng cho công nghệ nuôi cấy sinh khối bioreactor (P.B. Ngọc et al., 2013).

Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ nhân sâm với bioreactor có dung tích 10.000 đến 20.000 lít. Sản phẩm này được làm nguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau trên thị trường. Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ.

Vào năm 2002, Sevon đã tổng kết lại những hợp chất alkaloid quan trọng nhất trong ngành dược được sản xuất bởi các hệ thống rễ tơ, bao gồm A. tropabelladonna L., Catharanthus tricophyllus L., và Datura candida (Dodds et al., 1995).

Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh rằng hàm lượng anthraquinone và alizarin trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubia peregrina L. tăng cao khi gắn đoạn gen mã hóa ra enzyme isochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo Banerjee và cs (2002) thì rễ tơ của A. belladonna được chuyển gen P450 2E1 thể hiện khả năng tổng hợp chất tự nhiên với mức độ rất cao (Lodhi et al., 1996; Banerjee et al., 2002).

Hình 1.4. Các hệ thống rễ tơ Sâm dây được nuôi cấy tại Viện CNSH

A- Sâm dây trên môi trường lỏng; B,C- Sâm dây trên hệ thống bioreactor; D- thu sinh khối Sâm dây

Nhờ vào những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả năng tổng hợp một số lượng lớn hợp chất tự nhiên, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên thông qua các hệ thống nuôi cấy liên tục. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất các sản phẩm hợp chất tự nhiên trên quy mô công nghiệp với hiệu xuất cao, giảm chi phí trong quá trình sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm. Bên cạnh việc chuyển T-DNA của A.

rhizogenes vào tế bào thì ta còn có thể chuyển các gene ngoại lai vào trong tế bào

thông qua việc tái tổ hợp đoạn gen đó vào trong đoạn T-DNA của A. rhizogenes. Các gene này có thể là gen biểu hiện ra các hợp chất mục tiêu hay có thể là các gene mã hóa các enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp ra hợp chất tự nhiên mong muốn. Phương pháp này có thể giúp ta điều khiển hay định hướng cho quá trình sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên ở rễ tơ để tổng hợp ra một loại hợp chất tự nhiên với hàm lượng cao.

Sản xuất hợp chất thứ cấp

Thông thường, nuôi cấy rễ cần có sự xuất hiện của các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, hay là sự có mặt của các chất này trong môi trường nuôi cấy. Phương pháp nuôi cấy rễ này tạo các dòng rễ sinh trưởng rất chậm và có thể dẫn đến tình trạng thiếu hụt hay tổng hợp kém các hoạt chất thứ cấp. Tuy nhiên, rễ tơ đã cải tiến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận các hợp chất có giá trị sinh học cao. Rễ tơ cũng đã cung cấp một nguồn hóa chất thiên nhiên dồi dào cho các ngành công nghiệp dược phẩm, hóa mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm (Giri

et al., 2000).

Kim và cs (2009) đã sử dụng 3 chủng A. rhizogenes là R1000, A4 và ATCC 15834 cảm ứng với loài Taxus cuspidata và thu nhận được 107 dòng rễ tơ. Trải qua quá trình sàng lọc cho 3 dòng rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường MS không chất điều hòa sinh trưởng, và có khả năng sinh tổng hợp taxol-một hợp chất có công dụng mạnh trong điều trị ung thư (Kim et al., 2009).

Bảng 1.3. Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học

(Giri et al., 2000).

Cây chủ Hoạt chất thứ cấp

Artemisia annua Artemisinin

Panax ginseng Saponin

Panax hybird Ginsenosides

Taxus cuspidata Taxus

Quá trình sinh tổng hợp các hợp chất trong rễ tơ được kiểm soát bởi hệ gen, nhưng nó cũng bị ảnh hưởng bởi yếu tố dinh dưỡng và các nhân tố môi trường. Để có thể đạt được hiệu suất cao nhất, các điều kiện nuôi cấy cần được tối ưu hóa và được kiểm soát chặt chẽ. Các yếu tố ảnh hưởng có thể là nguồn cacbon, nguồn nitơ tổng, hàng loạt các yếu tố khác liên quan đến điều kiện nuôi cấy: ánh sáng,

nhiệt độ hay sự hiện diện của các chất hóa học có khả năng đẩy mạnh sự tổng hợp.

Ứng dụng của rễ tơ trong phân tích chức năng của gen

Rễ tơ không chỉ được ứng dụng để sản xuất hợp chất thứ cấp mà còn được sử dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu chức năng gen. Các đoạn gen chức năng được tái tổ hợp với gen chỉ thị Gus, hoặc chỉ thị bằng huỳnh quang và được đưa vào A. rhizogenes để chuyển vào thực vật. Thông qua quá trình biểu hiện của gen chỉ thị Gus mà các gen chuyển vào rễ tơ được nghiên cứu chức năng. Một ví dụ là gen Gus kết hợp với promotor alcohol dehydrogenase (Adh) và được chuyển vào rễ tơ đậu nành. Chức năng của promotor được nghiên cứu dưới các điều kiện môi trường như: nhiệt độ thấp, thiếu khí, bị tổn thương và xử lý acid abscisic. Tất cả các chức năng đều được nghiên cứu thông qua sự biểu hiện của gen gus (Zhi

et al., 2006).

Biểu hiện protein ngoại lai

Rễ tơ còn được dùng để biểu hiện các protein công nghiệp và các loại protein chức năng. Nhờ vào khả năng chuyển một đoạn gen ngoại lai vào thực vật, A.

rhizogenes đã được thiết kế mang các vector tái tổ hợp để có thể biểu hiện các

loại protein trong rễ tơ. Các gen ngoại lai này được gắn kết vào genome thực vật và ổn định về mặt di truyền nên khả năng biểu hiện không bị suy giảm. Ryan (2008) đã tạo thành công dòng rễ tơ mang gen mã hóa cho acetylcholinesterase- một protein có khả năng xử lý các hợp chất phosphat gây độc cho cơ thể. Các dòng rễ này tuy tăng trưởng chậm nhưng có hàm lượng acetylcholinesterase lên tới 3,3 % hàm lượng protein tổng số (Ryan et al., 2008). Mặt khác, các nghiên cứu cho thấy có thể tạo rễ tơ mang cấu trúc kháng thể ở người hay cấu trúc vỏ protein của các virus gây bệnh nhằm bước đầu tạo nguồn vaccine thực vật. Sharp (2001) đã thành công trong việc tạo dòng rễ tơ thuốc lá mang kháng thể đơn dòng IgGI ở người (Sharp et al., 2001).

Với tiềm năng to lớn của hệ thống rễ tơ, các hệ thống rễ tơ của nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất hợp chất tự nhiên in

vitro. Đặc biệt là rễ tơ của những cây thuốc quý có ứng dụng lớn trong ngành

công nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (codonopsis sp ) trong hệ thống bioreactor (Trang 26 - 31)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(70 trang)