M: Thang chuẩn của hãng Thermo
(A): Sản phẩm cắt vector pBT bằng enzyme giới hạn SacI và HindIII (Giếng 1(A): Plasmid pBT-gp5 gốc. Giếng 2: Plasmid pBT-gp5 sau khi xử lý bằng enzymme cắt giới hạn SacI và HindIII)
1(B): Điện di tinh sạch sản phẩm DNA gp5
Qua hình 3.2 A cho thấy ở giếng số 1 có 2 băng đậm và sáng là chiều dài của pBT-gp5. Có hai băng bởi vì plasmid tồn tại ở hai dạng xoắn và siêu xoắn, siêu xoắn tốc độ di chuyển nhanh hơn. Ở giếng số 2 có thêm một băng so với giếng 1, điều này là do sau khi chúng ta sử dụng enzyme cắt sẽ xuất
hiện đoạn gen này. Kích thƣớc của đoạn gen này khoảng 650bp, đây chính là đoạn gen mã hóa gp5. Tuy nhiên, để thu đƣợc đoạn gen này cần tiến hành tinh sạch từ gel agarose (Hình 3.2 B).
Trên hình 3.2 B là kết quả sau khi tiến hành tinh sạch gp5 từ gel agarose bằng bộ kít của hãng “Thermo scientific’’. Kết quả trên cho thấy băng 650 bp trùng khớp với kích thƣớc của gp5 và có độ tinh sạch cao, đảm bảo cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5
Mở vòng vector pET 32a(+)
Vector biểu hiện pET 32a(+) cũng đƣợc xử lý bằng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII tạo đầu dính bổ sung với gen gp5. Hỗn hợp đƣợc ủ trong 5 giờ ở 37oC sau đó tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả trên hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) bằng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII
Giếng 1, pET 32a(+) gốc, Giếng 2 pET 32a(+) sau khi được cắt bằng
enzyme giới hạn SacI và HindIII.
Ở hình 3.3 giếng 1 có hai băng sáng vì plasmid có cấu trúc dạng xoắn và siêu xoắn, giếng thứ 2 chỉ có một băng vì sau khi xử lý bằng enzyme SacI và HindIII plasmid chuyển thành dạng thẳng. Nhƣ vậy, việc cắt vector pET
32a(+) đã thành công. Tiến hành tinh sạch để loại bỏ các thành phần phụ trong phản ứng cắt mở vòng pET 32a(+) để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Ghép nối plasmid pET 32a(+) với gen gp5 tạo vector tái tổ hợp
Để thu đƣợc vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa protein GP5 tiến hành phản ứng nối vector pET 32a(+) đã mở vòng với DNA gp5. Hỗn hợp của phản ứng nối đƣợc ủ trong tủ ổn nhiệt với nhiệt độ 22oC trong thời gian 3 giờ. Sau đó biến nạp vào chủng biểu hiện E.coli BL21 để tạo
chủng biểu hiện mang vector tái tổ hợp.
Plasmid sau khi đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli đƣợc cấy trải trên
môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh Carbecicilin (100 mg/ml) nuôi ở 37oC trong 16 giờ, lựa chọn khuẩn lạc đơn trên môi trƣờng LB đặc chuyển sang nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh Carbecicilin (100 mg/ml) nuôi ở 37o
C trong 16 giờ. Tiến hành tách plasmid tái tổ hợp và tiến hành phản ứng cắt kiểm tra.
Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET 32a(+)-gp5 bằng enzyme cắt giới hạn.
Để kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) có mang gen gp5 hay không. Chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) bằng
enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII kết quả đƣợc kiểm tra trên gel agarose
0.8% (Hình 3.4).
Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII
M: thang chuẩn 1kb của hãng Thermo
Giếng 1: pET 32a(+)-gp5 đƣợc xử lý bằng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII.
Từ Hình 3.4 (giếng 1) có thể thấy sau khi xử lý bằng enzyme cắt giới hạn
SacI và HindIII đã tạo đƣợc băng sáng kích thƣớc xấp xỉ 6kb chứng tỏ plasmid
pET 32a(+) đã đƣợc cắt bằng cắt giới hạn SacI và HindIII chuyển thành mạch
thẳng. Một băng có kích thƣớc xấp xỉ 0,65 kb đây chính là kích thƣớc của gp5 sau khi cắt bởi enzyme giới hạn SacI và HindIII. Nhƣ vậy, việc tạo vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa cho protein GP5 đã thành công. Chúng tôi tiến hành biểu hiện protein GP5 trong tế bào E.coli chủng BL21.
3.3. Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E.coli
Biểu hiện protein GP5
liệu, phƣơng pháp. Theo lý thuyết GP5 đƣợc biểu hiện số lƣợng lớn dƣới dạng protein dung hợp với Trx (gọi tắt là TrxGP5) và protein tạo thành có khối lƣợng phân tử khoảng 43 kDa.
Dịch nuôi chứa E.coli BL21 mang vector pET 32a(+)/gp5 đƣợc nuôi
trong 16 giờ sau đó tiếp tục nuôi biểu hiện trong môi trƣờng LB lỏng ở 30oC trong 5 giờ có bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ 0,5 mM. Kết quả sau khi điện di SDS-PAGE (Hình 3.5) cho thấy phân đoạn 43 kDa phân đoạn này không xuất hiện ở mẫu đối chứng cảm ứng IPTG.
Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE dịch nuôi vi khuẩn mang vector tái tổ hợp
M: Thang chuẩn của hãng Thermo
Giếng 1: E.coli BL21mang plasmid tái tổ hợp pET32/Trxgp5
Giếng 2 DC: E.coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) (đối chứng)
Tế bào E. coli BL21 mang vector pET 32a(+) không chứa gen ngoại lai nên không có protein tái tổ hợp (đối chứng âm). Trên bản điện di (Hình 3.5) ở giếng 1 (E. coli BL21 mang pET32/Trxgp5) có một vạch protein khối lƣợng khoảng 43 kDa rất đậm tƣơng ứng với kích thƣớc TrxGP5 mà ở đƣờng chạy đối chứng không có. Trong khi đó tại giếng số 2 E.coli BL21
mang plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) không mang gen GP5 nên không thấy xuất hiện vạch tại vị trí có kích thƣớc 43 kDa. Do đó, có thể khẳng định protein tái tổ hợp TrxGP5 đã đƣợc tổng hợp trong tế bào E. coli và có kích
thƣớc đúng với kích thƣớc lý thuyết và có hàm lƣợng lớn.
Để tiến hành tinh chế protein cần phải phá vỡ lƣợng lớn tế bào nhằm thu protein tổng số và loại bỏ những thành phần không cần thiết.
Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp bằng Western blot
Để xác định protein, biểu hiện và tinh sạch đƣợc là GP5/His-tag, tiến hành kỹ thuật lai Western blot sử dụng kháng thể kháng trình tự His-tag với nồng độ pha loãng 1:1000 lần. Kết quả cho thấy trong dịch chiết tế bào đã thu đƣợc băng protein có kích thƣớc 43kDa (Hình 3.6). Chứng tỏ GP5 đã đƣợc biểu hiện thành công trong tế bào E.coli BL21. Kết quả này cũng chỉ ra việc sử dụng cột sắc ký ái lực Ni-NTA đã cho phép tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp GP5.
Hình 3.6. Kết quả phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag (pha loãng 1:1000 lần)
M: thang chuẩn của hãng Thermo 1: phân đoạn thu mẫu
(-) đối chứng âm
Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh chế protein tái tổ hợp
Cột tinh chế protein đƣợc thiết kế có giá thể gắn với ion kim loại Ni2+ nhờ phức hợp càng cua, ion này có ái lực rất lớn với vòng Imidazol của histidine. Khi cho các protein tổng số qua cột, protein nào có chứa amino acid histidine sẽ đƣợc giữ lại cột bởi tƣơng tác Imidazol - Ni2+, còn các protein không chứa vòng Imidazol của histidine sẽ đi ra khỏi cột. Ái lực giữa ion kim loại và protein mạnh hay yếu phụ thuộc vào protein đó có nhiều Histidine không và các Histidine đó có nằm sát nhau hay không. Nếu protein có nhiều Histidine và các Histidine đó nằm gần nhau thì liên kết giữa chúng với ion kim loại càng mạnh.
Vector biểu hiện pET 32a(+) đƣợc thiết kế sao cho sau khi dịch mã ra protein tái tổ hợp có mang 6 Histidine (Hexa histidine) nên chúng có ái lực rất cao với ion Ni2+. Khi cho mẫu chứa protein tổng số đi qua cột thì những protein nào không có hoặc chứa ít Histidine sẽ đi ra khỏi cột, lúc này trên cột là những protein có histidine liên kết với ion Ni2+. Nhƣng mức độ liên kết này lại khác nhau vì protein chứa nhiều amino acid Histidine sẽ liên kết với ion kim loại mạnh hơn và ngƣợc lại.