Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS

Nhóm 1(14 chủng): Saccharomyces cerevisiae MQY 4.1

Nhóm 2 (2 chủng): Wickerhamomyces anomalus MQY 11.3

Nhóm giả men

Có 12 chủng. Saccharomycopsis fibuligera MQS 14.1

Hình 3. 1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các nhóm nấm đại diện Nấm mốc:

Nhóm 1 (18 chủng): Nhóm này có hình thái khuẩn lạc màu xám ghi, hệ sợi phát triển nhanh, túi bào tử màu đen. Dễ thấy, nhóm khuẩn lạc này rất phổ biến, chúng xuất hiện ở hầu hết các bánh men từ MQ4 đến MQ15.

Nhóm 2 (8 chủng): Nhóm này đặc trưng bởi hình thái khuẩn lạc màu đen, hệ sợi bò lan, ít hoặc không có hệ sợi khí, bào tử đen to. Khi quan sát tiêu bản có rễ. Nhóm này cũng khá phổ biến, chúng xuất hiện ở 7 bánh men MQ 1,4,5,6,10,11,14.

Nhóm 3 (3 chủng): Khuẩn lạc màu sáng, hệ sợi dày bò lan, không có hệ sợi khí. Khi quan sát tế bào có nhiều Chlamydospore. Nhóm này tần xuất xuất hiện thấp, chỉ có mặt ở bánh men MQ3, MQ12, và MQ14.

Nhóm 4 (5 chủng): Khuẩn lạc màu trắng sữa phát triển nhanh, hệ sợi bò lan là chủ yếu, không vách ngăn, dường như không quan sát thấy túi bào tử. Khi làm tiêu bản để quan sát tế bào thì thấy rất nhiều Chlamydospore ở giữa sợi nấm. Nhóm này chỉ xuất hiện ở 4 bánh men duy nhất là MQ2,3,7,8

Nhóm 5 (7 chủng): Hệ sợi màu trắng, bò lan và cả sợi khí phát triển tốt. Túi bào tử to, màu trắng, hệ sợi không vách ngăn, và không quan sát thấy rễ nấm. Nhiều Chlamydospore giữa sợi nấm. Các chủng thuộc nhóm này được tìm thấy ở MQ2, MQ9, MQ12, và MQ15.

Nhóm 6 (4 chủng): Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, phát triển nhanh, vừa bò lan vừa có hệ sợi khí, túi bào tử lớn màu đen có thể nhìn thấy bằng mắt thường, khi già khuẩn lạc nhìn có màu hơi nâu. Nhóm này chỉ thấy ở 3 bánh men là MQ1, MQ5 và MQ7

Nhóm 7 (12 chủng): Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, phát triển nhanh, chủ yếu bò lan, hệ sợi khí mọc thưa, túi bào tử lớn màu đen, ít hơn nhưng to hơn bào tử ở nhóm 6, có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Sợi có nhiều Chlamydospore. Các chủng thuộc nhóm này xuất hiện ở nhiều các bánh men như MQ2,4,5,6,10,11,14

Nhóm 8 (3 chủng): Khuẩn lạc màu trắng điển hình, sợi mảnh, hệ sợi khí phát triển tốt. Túi bào tử hình cầu. Nhóm này xuất hiện khá ít, chỉ ở 3 bánh men MQ9,11,14.

Nhóm 9 (1 chủng): Nhóm này duy nhât phân lập được 1 chủng, xuất hiện ở bánh men MQ12. Khuẩn lạc màu trắng xốp, sợi mảnh, bào tử đính tròn nhỏ.

Nhóm 10 (4 chủng): Khuẩn lạc màu đậm đặc trưng, hệ sợi dày, Túi bào tử hình cầu. Các chủng thuộc nhóm này được phân lập từ 3 bánh men là MQ2,3,13.

Nhóm 11 (5 chủng): Các chủng thuộc nhóm này thường khuẩn lạc có màu vàng ghi đặc trưng, Bào tử có màu vàng nhạt, sợi liên tục phân nhánh, với các nhánh dài. Túi bào tử có màu vàng đến nâu. Cuống gần hình cầu, cao. Bào tử có vách trơn,

gần cầu tới elip, và có đường kính 4-5 µm. Các chủng thuộc nhóm này thuộc các bánh men MQ1,8,9.

Nhóm 12 (2 chủng): Khuẩn lạc màu vàng nhạt, sợi mọc lan, ở giữa có ít sợi khí mọc lên, bào tử. Túi bào tử to, hình tròn đính với cuống lớn hình trụ, bào tử nhỏ hình gần cầu, elip. Nhóm này rất hiếm gặp, chỉ thấy ở bánh men MQ10.

Nhóm 13 (2 chủng): Khuẩn lạc có màu vàng nhạt, hệ sợi phát triển chậm, bào tử đính hình tròn. Chỉ duy nhất bánh men MQ8 có sự xuât hiện nhóm chủng này.

Nấm men:

Nhóm 1: (13 chủng): Khuẩn lạc màu trắng sữa, nhẵn bóng, tế bào gần cầu, có những tế bào dài đang phân đôi. Nhóm chủng này rất phổ biến, xuất hiện ơ nhiều bánh men như MQ2,3,4,7,8,9,11,12,13.

Nhóm 2 (2 chủng): Khuẩn lạc có màu trắng sáng, sáng hơn nhóm 1, tế bào tròn, nhiều tế bào quan sát được đang phân đôi, nảy chồi. Nhóm này chỉ có 2 chủng duy nhất thuộc 2 bánh men MQ9 và MQ11.

Giả men:

Nhóm 1 (12 chủng): Khuẩn lạc màu trắng sữa, xù xì. Khi quan sát tế bào thì có nhiều sợi và bào tử

Như vậy, kết quả cho thấy hầu hết các chủng vi nấm được phân lập là nấm mốc với độ đa dạng về hình thái khuẩn lạc và tế bào hơn là nấm men và giả nấm men.

3.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh chủng nấm đại diện dựa vào phân tích trình tự rDNA

Việc phân loại bước đầu các chủng nấm mốc bằng hình thái khuẩn lạc và tế bào tương đối nhanh do sự sai khác khá điển hình giữa các nhóm. Tuy nhiên, với các chủng nấm men hay giả men thì do sự đa dạng và sự sai khác không rõ ràng giữa các chủng về mặt hình thái khuẩn lạc cũng như tế bào làm cho việc phân loại dựa vào những đặc điểm này gặp nhiều khó khăn, phân nhóm bằng hình thái là một bước để giảm bớt sự khó khăn khi phân nhóm bằng các phương pháp tiếp theo. Để đánh giá tính đa dạng của các chủng phân lập được một cách chính xác, chúng tôi tiến hành phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 103 chủng phân lập được sử dụng mồi MST2

(có trình tự 5’-(GAC)5-3’). Kết quả phân nhóm bằng fingerprinting được đối chiếu lại với kết quả phân nhóm bằng hình thái.

Hình 3. 2. Phổ băng DNA fingerprinting

Ký hiệu: 1-MQF 4.2; 2- MQF 4.4; 3- MQF 5.2; 4 - MQF 5.6; 5 - MQF 6.4; 6 - MQF 6.5; 7 - MQF 7.2; 8 - MQF 8.3; 9 - MQF 9.5; 10 - MQF 10.3; 11 - MQF 11.1; 12 - MQF 12.5; 13 - MQF 14.3; 14 - MQF 14.7; 15 - MQF 14.8; 16 - MQF 15.3; 17 - MQF 10.1; 18 - MQF 13.1; 19 - MQF 1.2; 20 - MQF 4.1; 21 - MQF 4.5; 22 - MQF 5.3; 23 - MQF 6.3; 24 - MQF 10.4; 25 - MQF 11.2; 26 - MQF 14.1; 27 - MQF 3.1; 28 - MQF 12.1; 29 - MQF 12.4; 30 - MQF 2.4; 31 - MQF 3.2; 32 - MQF 8.2; 33 - MQF 2.5; 34 - MQF 9.1; 35- MQF 9.6; 36 - MQF 12.6; 37 - MQF 15.1; 38 - MQF 15.2; 39 - MQF 15.4; 40 - MQF 1.3; 41 - MQF 1.4; 42 - MQF 5.7; 43 - MQF 7.1; 44 - MQF 7.3; 45 - MQF 8.1; 46 - MQF 2.1; 47 - MQF 4.3; 48 -MQF 5.1; 49 - MQF 5.4; 50 - MQF 5.5; 51 - MQF 6.1; 52 - MQF 6.2; 53 - MQF 10.5; 54 - MQF 10.6; 55 - MQF 14.4; 56 - MQF 14.5; 57 - MQF 9.4; 58 - MQF 11.3; 59 - MQF 14.2; 60 - MQF 12.2; 61 - MQF 2.2; 62 - MQF 2.3; 63 - MQF 3.3; 64 - MQF 13.2; 65 - MQF 1.1; 66 - MQF 8.4; 67 - MQF 8.7; 68 - MQF 9.3; 69- MQF 9.7; 70 - MQF 10.2; 71 - MQF 10.7; 72 - MQF 8.5; 73 - MQF 8.6; 74- MQY 2.1; 75- MQY 3.1; 76- MQY 4.1; 77- MQY 4.2; 78- MQY 7.2; 79- MQY 8.1; 80- MQY 8.2; 81- MQY 9.2; 82- MQY 11.1; 83- MQY 11.2; 84- MQY 12.1; 85- MQY 12.2; 86- MQY 13.1; 87- MQY 7.1; 88- MQY 9.3; 89- MQY 11.3; 90- MQS 8.1; 91- MQS 8.2; 92- MQS 3.2; 93- MQS 3.1; 94- MQS 2.2; 95- MQS 2.1; 96- MQS 12.1; 97- MQS 12.2; 98- MQS 13.2; 99- MQS 13.1; 100- MQS 9.2; 101- MQS 14.1.

Kết quả thể hiện ở hình 3.2 cho thấy, sản phẩm PCR nhân với mồi MST2 của các chủng nấm có các phổ băng khác nhau và rất đa dạng do sự phân bố về số lượng bản sao cũng như vị trí của DNA vệ tinh trong genome. Kỹ thuật phân nhóm sử dụng mồi thiết kế dựa trên DNA vệ tinh cho độ phân giải đến loài. Các chủng có cùng hình thái khuẩn lạc, được điện di cạnh nhau, và cho phổ finger giống nhau như nhóm 1, nhóm 2, nhóm 3. Bên cạnh đó, các chủng có hình thái khuẩn lạc khác nhau nhưng lại cho cùng phổ finger như các chủng thuộc nhóm 4,5,6,7. Tùy thuộc vào vị trí phân bố trên DNA mà số lượng vạch DNA giữa các nhóm có thể khác nhau, ví dụ như nhóm 6,7,8 có nhiều băng DNA nhưng nhóm 9 hay 13 chỉ có 1 băng DNA duy nhất. Các chủng vừa có hình thái giống nhau, vừa có băng finger giống nhau sẽ được xếp cùng nhóm. Theo cách đó chúng tôi đã chia 73 chủng nấm mốc thành 13 nhóm, 16 chủng nấm men thành 2 nhóm, và 12 chủng giả nấm men.

Bảng 3. 1. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting và đọc trình tự các chủng đại diện

Nhóm Chủng

Chủng đọc trình

tự

Tên khoa học

Nấm mốc 1 (18 chủng) MQF 4.2, MQF 4.4, MQF 5.2, MQF 5.6, MQF 6.4, MQF 6.5, MQF 7.2, MQF 8.3, MQF 9.5, MQF 10.3, MQF 11.1, MQF 12.5, MQF 14.3, MQF 14.7, MQF 14.8, MQF 15.3, MQF 10.1, MQF 13.1 MQF 4.2 Rhizopus microsporus 2 (8 chủng) MQF 1.2, MQF 4.1, MQF 4.5, MQF 5.3, MQF 6.3, MQF 10.4, MQF 11.2, MQF 14.1 MQF 5.3 Rhizopus microsporus 3 (3 chủng) MQF 3.1, MQF 12.1, MQF 12.4 MQF 12.1 Mucor indicus 4 (5 chủng) MQF 2.4, MQF 3.2, MQF 7.3, MQF 8.1, MQF 8.2 MQF 2.4 Rhizopus oryzae 5 (7 chủng) MQF 2.5, MQF 9.1, MQF 9.6, MQF 12.6, MQF 15.1, MQF 15.2, MQF 15.4 MQF 2.5 Rhizopus oryzae

6 (4 chủng) MQF 1.3, MQF 1.4, MQF 5.7, MQF 7.1 MQF 1.3 Rhizopus oryzae

7 (11 chủng) MQF 2.1, MQF 4.3, MQF 5.1, MQF 5.4, MQF 5.5, MQF 6.1, MQF 6.2, MQF 10.5, MQF 10.6, MQF 14.4, MQF 14.5 MQF 10.5 Rhizopus oryzae

Nhóm Chủng

Chủng đọc trình

tự

Tên khoa học

9 (1 chủng) MQF 12.2 MQF

12.2

Cunninghamella bertholletiae

10 (3 chủng) MQF 2.2, MQF 2.3, MQF 3.3 MQF 2.2 Mucor circinelloides

11 (6 chủng) MQF 13.2, MQF 1.1, MQF 8.4, MQF 8.7, MQF 9.3, MQF 9.7 MQF 8.4 Mucor indicus 12 (2 chủng) MQF 10.2, MQF 10.7 MQF 10.2 Mucor indicus 13 (2 chủng) MQF 8.5, MQF 8.6 MQF 8.6 Cunninghamella echinulata Nấm men 1

(14 chủng) MQY 2.1, MQY 3.1, MQY 4.1, MQY 4.2, MQY 7.2, MQY 8.1, MQY 8.2, MQY 9.2, MQY 11.1, MQY 11.2, MQY 12.1, MQY 12.2, MQY 13.2, MQY 7.1

MQY 4.1 Saccharomyces

cerevisiae

2 (2 chủng) MQY 9.3, MQY 11.3 MQY

11.3 Wickerhamomyces anomalus Giả men 1 (12 chủng) MQS 8.1, MQS 8.2, MQS 3.2, MQS 3.1, MQS 2.2, MQS 2.1, MQS 12.1, MQS 12.2, MQS 13.2, MQS 13.1, MQS 9.2, MQS 14.1 MQS 14.1 Saccharomycopsis fibuligera

Xếp nhóm và phân loại các chủng dựa vào hình thái và đặc điểm sinh lý thường rất khó và tốn thời gian. Các loài khác nhau có thể có hình thái giống nhau và các chủng cùng loài có thể có nhiều kiểu hình. Bằng việc sử dụng mồi PCR (GAC)5

khuếch đại các đoạn ADN vệ tinh có thể xếp nhóm thành công một lượng lớn các chủng vi nấm.

Dựa vào kết quả phân nhóm bằng fingerprinting chúng tôi chọn ra 16 chủng đại diện của 16 nhóm (bảng 3.2) để phân tích trình tự. Chúng tôi chọn đoạn D1/D2 của rDNA 26S và vùng ITS của rDNA để phân tích. Do kích thước của các đoạn này khá ngắn (khoảng 600 bp), tính bảo thủ rất cao giữa các loài. Đồng thời, trình tự của các đoạn này của các loài đã biết đã được công bố trên GenBank, nên dễ dàng cho việc so sánh trình tự với các loài mới phân lập được. Như vậy với các ưu điểm này, đoạn D1/D2 và vùng ITS rất thích hợp cho việc phân tích trình tự để định tên nấm

DNA của 13 chủng nấm mốc được tách sau đó dùng PCR nhân đặc hiệu đoạn DNA chứa vùng ITS, nấm men, giả nấm men nhân đoạn D1/D2 bằng cặp mồi ITS1 và NL4. Sản phẩm PCR sau đó được tinh chế và đọc trình tự với mồi ITS4 (nấm mốc), NL4 (nấm men, giả men). Kết quả đọc trình tự sau đó được so sánh với các chủng đã được công bố.

Từ kết quả đọc trình tự các chủng đại diện ở bảng 3.2, ta thấy đối với các chủng nấm mốc.

- Loài Rhizopus oryzae, chiếm 27 chủng (tổng của 5 chủng nhóm 4, 7 chủng nhóm 5, 4 chủng nhóm 6 và 11 chủng nhóm 7).

- Loài Rhizopus microsporus chiếm 26 chủng (tổng của 26 chủng nhóm 1 và 8 chủng nhóm 2)

- Loài Mucor indicus chiếm 11 chủng (3 chủng nhóm 3, 6 chủng nhóm 11 và 2 chủng nhóm 12)

- Loài Mucor circinelloides có 3 chủng (3 chủng nhóm 10)

- Loài Lichtheimia ramosa có 3 chủng (3 chủng nhóm 8), loài Cunninghamella echinulata có 2 chủng, và 1 chủng Cunninghamella bertholletiae.

Từ đó có thể kết luận rằng, loài nấm mốc thường gặp ở các bánh men là

Rhizopus oryzae, chiếm 27 chủng trong số 73 chủng nấm được xác định và tiếp theo là Rhizopus microsporus (26 chủng), Mucor indicus (11 chủng), Mucor circinelloides

(3 chủng), Lichtheimia ramosa (3 chủng), Cunninghamella echinulata (2 chủng),

Cunninghamella bertholletiae (1 chủng). Trong 1 nghiên cứu trước về đa dạng vi sinh vật trong bánh men truyền thống thì các chủng nấm thuộc họ Mucoraceae không phổ biến mà loài nấm giả men Saccharomyscopsis fibuligera mới là loài phổ biến hơn cả [21]. Saccharomyscopsis fibuligera cũng là loài sinh amylase chính ở Loog-pang – một loại giống khởi động truyền thống ở Thái Lan, tương tự như bánh men Việt Nam. Trong số các chủng nấm men phân lập được thì chủ yếu các chủng thuộc loài

S.cerevisiae (14 chủng-nhóm 1), Wickerhamomyces anomalus (2 chủng-nhóm 2), và 12 chủng giả nấm men. S. fibuligera. Một nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng loài nấm S. cerevisiae đóng vai trò chủ yếu trong quá trình lên men rượu vì chúng được tìm thấy ở tất cả các giai đoạn của quá trình lên men và đến ngày cuối cùng thì chỉ có

sự hiện diện thuần nhất của chúng bên cạnh vi khuẩn, đây được giải thích là kết quả của việc thuần hóa lâu dài [25].

Kết quả phân lập này tương đồng với nghiên cứu trước đây của Thanh VN và cộng sự, từ 130 chủng vi nấm được phân lập từ các giai đoạn khác nhau của lên men rượu gạo. Trong đó, 41 chủng thuộc họ Mucoraceae, 16 chủng giả men là S .fibuligera, 29 chủng nấm men, chủ yếu là S.cerevisiae [25].

Quá trình lên men gần như thiếu Aspergillus, Trichoderma và Penicillum, loại nấm hoại sinh phổ biến nhất trong môi trường trong nhà. Lên men rượu truyền thống của Việt Nam khác biệt đáng kể với quá trình lên men của rượu sake Nhật Bản, nơi

Aspergillus spp. là chủ yếu. Đặc điểm này là do độ ẩm cao của cơ chất được sử dụng trong quá trình lên men rượu của Việt Nam. Độ ẩm ban đầu của bột làm bánh men và cơm hấp để lên men rượu nằm trong khoảng từ 50% đến 55%. Đây là điều kiện thuận lợi cho Mucorceae phát triển vì chúng thích nghi với cơ chất có hàm ẩm cao, điều kiện lên men vi hiếu khí.

3.4. Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS

Như đã biết, các chủng nấm mốc chủ yếu sinh enzym amylase để thủy phân cơ chất tinh bột thành đường khử, nên tiến hành phân tích hoạt lực enzyme amylase với cơ chất là tinh bột hòa tan rồi đo sản phẩm đường khử bằng DNS để xem khả năng thủy phân tinh bột của các nhóm chủng nấm mốc nhanh hay chậm.

Sau 2 ngày bổ sung chủng mốc với cơm gạo nuôi ở 30ºC dịch đường hóa được chiết bằng đệm CH3COONa 0.5M rồi ly tâm. Phần dịch phía trên của ống ly tâm chứa amylase ngoại bào được phân tích hoạt lực bằng phương pháp DNS. Sau đây là bảng kết quả hoạt lực amylase của 67 chủng nấm mốc Mucoraceae và 1 chủng đối chứng

Cunninghamella echinulata MQF 8.5 (C. echinulata MQF 8.5).

Bảng 3. 2. Hoạt lực enzyme amylase của các chủng mốc thuần

STT Chủng Hoạt lực amylase STT Chủng Hoạt lực amylase (IU/ml) (IU/ml) 1 M. circinelloides MQF 2.2 1,89 35 R.microsporus MQF 4.5 10,17 2 M. circinelloides MQF 2.3 2,06 36 R.microsporus MQF 5.3 6,92

3 M. circinelloides MQF 3.3 2,13 37 R.microsporus MQF 6.3 11,31 4 M. circinelloides MQF 13.2 4,88 38 R.microsporus MQF 10.4 6,91 5 M. indicus MQF 3.1 0,77 39 R.microsporus MQF 11.2 13,3 6 M. indicus MQF 12.1 2,03 40 R.microsporus MQF 14.1 8,57 7 M. indicus MQF 12.4 2,14 41 R.oryzae MQF 2.4 133,46 8 M. indicus MQF 1.1 2,43 42 R.oryzae MQF 3.2 117,5 9 M. indicus MQF 8.4 1,15 43 R.oryzae MQF 7.3 80,77 10 M. indicus MQF 8.7 1,88 44 R.oryzae MQF 8.1 61,35 11 M. indicus MQF 9.3 1,27 45 R.oryzae MQF 8.2 73,76 12 M. indicus MQF 9.7 2,68 46 R.oryzae MQF 2.5 50,5 13 M. indicus MQF 10.2 6,14 47 R.oryzae MQF 9.1 125,6 14 M. indicus MQF 10.7 3,51 48 R.oryzae MQF 9.6 72,06 15 R.microsporus MQF 4.2 7,06 49 R.oryzae MQF 12.6 74,23