Chế phẩm Bio-A - (LUẬN văn THẠC sĩ) phân lập và- 123docz.net

Nghiên cứu sự gây ha ̣i của nấm sợi trên kính quang ho ̣c đã được mô ̣t số tác giả trong nước như Đặng Hồng Miên, Phạm Hồ Trương đề cập từ những năm 80 trở về trước . Tiến sĩ Pha ̣m Hồ Trương (Viê ̣n KH&CN Quân sự) đã nghiên cứu khả năng ức chế của NT (dẫn xuất của Thymol) chống nấm mốc quang ho ̣c và hiê ̣n nay chế phẩm không được áp du ̣ng trong khí tài quang ho ̣c do sau mô ̣t thời gian bảo quản vẫn ta ̣o mô ̣t lớp sương mù trên bề mă ̣t chi tiết kính quang ho ̣c và làm tăng hệ số chiết quang của hệ thống quang học [1].

Với các yêu cầu về chất kháng nấm có các đă ̣c điểm như : thăng hoa thành thể hơi đô ̣c với nấm mà không đô ̣c với con người, không ăn mòn các kết cấu của kính và không ngưng đọng trên bề mặt các lăng kính , thấu kính và không ảnh hưởng đến đô ̣ trong suốt của chúng. Các yêu cầu đưa ra tương tự các tiêu chí mà Olympus lựa cho ̣n đối với chất chống nấm . Từ các căn cứ trên Phân viê ̣n Công nghê ̣ Sinh ho ̣c – Trung tâm nhiê ̣t đới Viê ̣t Nga đã chế ta ̣o chế phẩm chống mốc phù hợp với yêu cầu của thiết bị quan sát quân sự . Chế phẩm Bio-A là da ̣ng viên nén mang một lượng chất kháng nấm . Đặt chế phẩm vào trong thiết bị quan sát nó sẽ thăng hoa từ từ và liên tục cho đến khi hết và tạo ra môi tr ường bên trong thiết bi ̣ luôn có mô ̣t lượng hơi chất làm cho nấm bi ̣ tiêu diê ̣t hoàn toàn . Chế phẩm Bio-A được thiết kế để nhả châ ̣m chất kháng nấm mu ̣c đích kéo dà i tác dụng của chế phẩm [3].

Hiê ̣n nay toàn bô ̣ thiết bi ̣ quan sát quân sự được lưu trữ ở các kho trên các vùng miền đang được bảo quản trong điều kiện bảo ôn theo tiêu chuẩn và không sử du ̣ng chất chống nấm . Tuy nhiên thiết bi ̣ quang ho ̣c ta ̣i các đơn vi ̣ phân tán nên khó áp du ̣ng công nghê ̣ này. Vì thế nghiên cứu và sử dụng chất chống nấm có nguồn gốc sinh học thân thiện môi trường là điều cần thiết.

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U

2.1. Vật liê ̣u nghiên cƣ́u

2.1.1. Mẫu vật phân lập nấm và chế phẩm kháng nấm

- Các mẫu kính quang học nhiễm nấm cấp độ 5 tại ba kho lưu trữ ở ba miền khí hậu Việt Nam: Xuân Mai- Hà Nội, Nghệ An và Đồng Nai được lấy trong gian đoạn tháng 6-8/2014. Mỗi kho lấy ngẫu nhiên 05 mẫu kính quang học nhiễm nấm, tổng số là 15 mẫu.

Chế phẩm Bio-A được chế tạo tại Phân Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm nhiệt đới Việt-Nga (Theo tiêu chuẩn TCQS-2015/NĐVN). Do yêu cầu bảo mật về kỹ thuật quân sự, thành phần cấu tạo của chế phẩm Bio-A không được công bố chi tiết trong khuôn khổ Luận văn này.

2.1.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Hóa chất : Glucose (Merck, Đức); Saccarose (Merck); NaNO3 (Merck, Đức); K2HPO4 (Merck, Đức); MgSO4 (Merck, Đức); FeSO4 (Merck, Đức); Skimilk (Merck, Đức);

Môi trườ ng PDA ( Potato Dextrose Agar, Merck, Đức).

Kít tách DNA tổng số Fungi/Yeast DNA Extraction (Norgen, Canada); d-NTP (Affymetric, Canada); Taq DNA polymerase (Thermo scientific, Mỹ)…

Thiết bi ̣ nghiên cứu: Máy soi gel (Nyx technik, L2126B, Mỹ); Máy PCR (Nyx technik , ATC 201, Mỹ; Kính hiển vi (Olympus, Nhật bản); Máy đo pH Hanna ( Ý , pH 211); Máy li tâm eppendoft (Đức); Bể hằng nhiệt hồi lưu (Hàn Quốc); Nồi hấp khử trùng (SANYO, Nhật) và một số thiết bị nghiên cứu khác.

2.1.3. Môi trƣờ ng nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng tro ng lưu giữ giống, phân lâ ̣p, xác định đặc điểm sinh ho ̣c và môi trường đánh giá khả năng sinh axit của nấm mốc được trình bày trong Phụ lục 1.

2.2. Phƣơng phá p nghiên cƣ́u

2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu, phân lập

Các mẫu kính được xác định vùng bị nhiễm nấm, sử dụng tăm bông sạch đã khử trùng quết lên bề mặt kính bị nhiễm nấm và cấy trải trên môi trường PDA, giữ ở nhiệt độ 30oC trong điều kiện tối. Sau 48-72 giờ nuôi cấy, các khuẩn lạc được quan sát, chọn lọc các chủng có đặc trưng hình thái khác nhau và cấy thuần trên môi trường đặc trưng cho nấm sợi [3, 24].

2.2.2. Phƣơng phá p giƣ̃ giống

Các chủng nấm đã được làm sạch sau đó cấy trên môi trường Czapek-Dox (Nấm sinh trưở ng tốt từ 3 – 5 ngày, lấy bào tử cho vào trong dung di ̣ch Sk imilk, sau đó lắc đều và hút 1ml di ̣ch bào tử vào từng ống ampul vô trùng . Đông khô dịch bào tử bằng thiết bị Alpha 1-2LD plus (Hàn Quốc), hàn kín ampul và bảo quản ở nhiệt độ phòng [3].

2.2.3. Quan sát đặc điểm hình thái và cấu trúc sinh bào tử nấm

Nấm được nuôi cấy trong tủ ấm 28- 30°C trên môi trường Czapek có cắm la men nghiêng. Sau 72 giờ, lấy ra quan sát hình thái cuống sinh bào tử và bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40, 100 lần. Các kiểu phát triển bào tử như: bào tử đính, bào tử túi, bào tử tản, bào tử nang... Màu sắc hệ sợi thường là: xanh, đen, trắng, xám, vàng... [19].

Đặc điểm hình thái cần quan sát gồm:

- Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, dạng bề mă ̣t khuẩn la ̣c, màu sắc khuẩn lạc ( màu sắc hệ sợi nấm, bào tử) và các đặc điểm khác

- Đặc điểm hiển vi của nấm: đă ̣c điểm của cơ quan sinh bào tử trần và bào tử trần (tế bào chân , giá sinh bào tử trần , bọng đỉnh gi á, cuống thể bình, thể bình, hình dạng, kích thước...), đă ̣c điểm của bào tử túi (thể quả, nang bào tử, bào tử túi).

- Dựa vào đă ̣c điểm hình thái và mô ̣t số khóa phân loa ̣i ta có thể đi ̣nh danh được tên của nấm sợi (Khóa phân loa ̣i của H.L.Barnet và cs; phân loa ̣i chi

Aspergillus sp. dùng khóa phân loại của Raper và Fennell, ...) [9, 26]. Ngoài ra, khóa phân loại của Katsuhiko Ando (2003) [19].

2.2.4. Tách DNA tổng số và PCR

Tách chiết DNA: Vi sinh vật được nuôi cấy 2 ngày trên môi trường thích hợp. Lấy 1 vòng que cấy khẩn ty vào ống eppendorf vô trùng, thêm 500 µl 2×SSC vào mỗi ống. Lắc đều và giữ ở 99°C trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nuớc cất vô trùng. Sau đó tiến hành tách DNA theo trình tự hướng dẫn của kít Fungi/Yeast DNA Extraction (Norgen, Canada). DNA sau khi tách chiết được giữ ở -20°C và dùng để làm khuôn cho các phản ứng PCR.

2.2.5.Phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự đoa ̣n ITS-18S rDNA

Đoa ̣n ITS-18S rDNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi ITS1F và ITS4 có trình tự trong bảng 2.1 [14, 40].

Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại

đoa ̣n ITS-18S rDNA

Tên đoa ̣n mồi Trình tự mồi

ITS1F 5'- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'

ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

Sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 1,0% trong đệm TAE, 110V trong 15 phút. Kích thước đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sá nh với thang chuẩn (Thermo scientific, Mỹ).

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra, tinh sạch, giải trên máy đọc trình tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại công ty 1st BASE (Singapore). Kết quả giải trình tự

gen được kiểm tra bằng phần mềm phân tích BioEdit (ver. 6.0.7, Mỹ), so sánh với các gen tương ứng đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Cây phát sinh chủng loại được xây dựng sử dụng phần mềm Treeview (ver. 1.6.6, Mỹ).

2.2.6.Xác định khả năng sinh axit của các chủng nấm sợi

Nuôi cấy các chủng nấm trên môi trường Czapek – Dox lỏng [3]. Sau 5 ngày nuôi cấy, đo giá trị pH của dịch nuôi cấy bằng thiết bị đo pH (HANNA 211, Ý).

2.2.7. Thƣ̉ nghiê ̣m gia tốc khả năng ƣ́c chế sƣ̣ sinh trƣởng của nấm sơ ̣i của

Bio-A theo TCVN 7699-2-10-2007.

Cấy bào tử các chủng nấm sợi thử nghiê ̣m trên môi trường tha ̣ch PDA , đă ̣t các đĩa Petri vào trong bình hút ẩm, đă ̣t chế phẩm Bio-A sao cho đa ̣t nồng đô ̣ 0,1; 1; 5; 10; 20 mg/L). Thử nghiê ̣m được duy trì ở đô ̣ ẩm khoảng 97%, nhiê ̣t đô ̣ 28 ± 2o

C. Sau 7 ngày và 28 ngày quan sát đánh giá kết quả . Mẫu đối chứ ng tiến hành tương t ự nhưng không có Bio-A. Nồng đô ̣ Bio-A có hiê ̣u quả nếu ức chế sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm sợi sau 28 ngày thử nghiệm [4].

2.2.8. Khả năng kháng nấm bảo vệ kính quang học của chế phẩm Bio -A

theo tiêu chuẩn ISO 9022-11

Thử nghiệm khả năng kháng nấm của chế phẩm Bio-A trên kính, với nồng độ lựa cho ̣n 1 mg/L. Lựa cho ̣n mô ̣t số chủng nấm (Bảng 2.2) trùng với danh sách các chủng nấm quy đi ̣nh trong tiêu chuẩn ISO (Phụ lục 3).

Bảng 2.2. Các chủng nấm sợi được sử dụng trong thử nghiê ̣m hiệu quả kháng nấm của chế phẩm Bio-A

STT Tên chủng thƣ̉ nghiê ̣m

1 Aspergillus niger B10 2 Aspergillus flavus B03 3 Aspergillus versicolor T08 4 Penicillium citrinum T12 5 Chaetomium globosum 15

Sử dụng các ch ủng nấm đã phân lập được trên các thiết bị quang học tại các kho khác nhau (phù hợp với khí hậu nhiệt đới). Các chủng được nuôi cấy trên môi trường thạch trong đĩa Petri.

Sử dụng 15 tấm kính có kích thước 20x10cm, khử trùng khô ở 180oC. Sau khi khử trùng, 15 tấm kính được tráng 1 lớp mỏng dung dịch chất dinh dưỡng (Phụ lục 2).

Dùng pipet hút 10ml nước cất đã khử trùng vào các đĩa P etri đã nuôi cấy, dùng que cấy để tách các bào tử nấm. Hút các bào tử nấm đã hòa trong dịch vào bình tam giác, sau đó tách sợi nấm bằng bông thủy tinh. Rửa các bào tử thu được mỗi loại nấm 3 lần. Pha loãng phần bào tử đã thu được với dung dịch muối khoáng đã nêu trong bảng 8 sao cho mỗi chủng loại nấm chứa 1.000.000±200.000 bào tử/mL. Trộn các dung dịch chứa bào tử nấm để có được dung dịch chứa hỗn hợp các bào tử nấm. Hỗn hợp bào tử nấm được phun đều lên bề mặt tấm kính, số lượng bào tử nấm trên bề mặt mẫu khoảng 15.000±3.000 bào tử/cm2

và không tạo giọt sương trên bề mặt.

Đặt 3 tấm kính đã được phun hỗn hợp bào tử vào mỗi decicater (Bình hút ẩm được duy trì độ ẩm khoảng 97% bằng dung dịch bão hòa K2SO4 vào thời điểm 4 giờ trước khi đưa mẫu vào). Mẫu chứng không bổ sung chế phẩm Bio-A và bình hút ẩm là thử nghiệm có bổ sung thêm chế phẩm Bio-A để đạt nồng độ trong bình hút ẩm theo yêu cầu thử nghiê ̣m.

Sau 7 ngày lấy các tấm để kiểm tra và đánh giá. (Nếu mẫu đối chứng hoặc dung dịch bào tử phun lên đĩa Petri có môi trường PDA không mọc thí nghiệm bị loại bỏ). Sau 28 ngày ta lấy các tấm kính ra để kiểm tra và đánh giá theo tiêu chuẩn. (Nếu mẫu đối chứng sau 28 ngày không mọc nhiều hơn sau 7 ngày thì thí nghiệm cũng bị loại bỏ).

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập nấm sơ ̣i trên chi ti ết kính của thiết bi ̣ quan sát quân sự tại Viê ̣t Nam

Quan sát các chi tiết của thiết bị quan sát quân sự nhận thấy các thấu kính (thị kính, lăng kính, vật kính) mất độ trong suốt, phân tán ánh sáng giảm và có dấu hiệu bị ăn mòn. Ngoài ra, lăng kính của hầu hết thiết bị bị ảnh hưởng rõ rệt nhất (Hình 3.1).

Các địa điểm được khảo sát với những điều kiện khí hậu trung bình năm khác nhau và đặc trưng cho 3 miền Bắc, Trung, Nam với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Trong số các điểm lấy mẫu đại diện tại Việt Nam, thiết bị quan sát trong các kho bảo quản ở Xuân Mai, Nghệ An, Đồng Nai bị ảnh hưởng bởi nấm nặng nhất (nhiễm nấm ở cấp độ 5 theo tiêu chuẩn ngành) và được lựa chọn để khảo sát. Từ 5 mẫu đại diện cho mỗi kho của ba miền Bắc, Trung, Nam đã phân lập được 61 chủng nấm. Dựa trên hình thái, màu sắc của khuẩn lạc nấm, đã xác được định mật độ các chủng nấm xuất hiện trong từng thấu kính riêng biệt, đạt trung bình 50-300 đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU)/thấu kính (kết quả không công bố chi tiết). Đánh giá về chủng loại nấm, đã xác định được đại diện nấm trong các mẫu

A B

Hình 3.1. Lăngkính của thiết bị quan sát quân sự bị nhiễm nấm. (A) Quan

lần lượt là: Xuân Mai - 22 chủng, Nghệ An - 23 chủng, Biên Hòa - 16 chủng (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Số lượng chủng nấm phân lập từ kính quang học nhiễm nấm

Địa điểm lấy mẫu

Ký hiệu loại thiết bị quan sát (nơi sản xuất) Số chủng xuất hiện Tổng số chủng XUÂN MAI MB1_ON 8x30 (Hungari) 5 MB2_ NVA 7x40 (Đức) 4 22 MB3_B41 (Đức) 5 MB4_ON 7x50 (Đức) 4

MB5_ON 6x30 (Liên Xô) 4

NGHỆ AN MT1_ ON 15x50 (Liên Xô) 6 23 MT2_ ON 7x50 (Triều Tiên) 4 MT3_ ON 6x30 (Liên Xô) 4 MT4_ ON 6x30 (Hungari) 5 MT5_ ON 6x30 (Tiệp Khắc) 4 ĐỒNG NAI MN1_ON D6 (Đức) 2 16 MN2_ ON 6x30 (Z133/VN) 3 MN3_ON 6x30 (Z133/VN) 5

MN4_ON 6x30 (Liên Xô) 3

MN5_ ON 6x30 (Liên Xô) 3

Các mẫu kính quân sự cho thấy hình thái của chủng loại nấm nhiễm trên mỗi thiết bị từ 2-6 loài. Trong đó, chủng loại nấm sợi ở hai kho thuô ̣c Xuân Mai và Nghệ An nhiều hơn so v ới mẫu tại Biên Hòa. Ngoài ra, theo Nguyễn Thu Hoài và cs, chủng loại nấm sợi trên thiết bi ̣ quan sát quân sự phân lâ ̣p từ 5 mẫu ở kho của xí nghiê ̣p 23 Phúc Yên, Vĩnh Phúc gồm 18 chủng [3]. Tổng hợp các kết

quả cho thấy số lượng các chủng nấm tại các kho lấy mẫu ở Đồng Nai thấp hơn so với hai kho ở Xuân Mai và Nghệ An, trên hầu hết các kính có nguồn gốc sản xuất trong nước và nước ngoài. Điều này có thể lý giải do độ ẩm không khí tại miền Nam thấp hơn miền Bắc và miền Trung Việt Nam nên số lượng và chủng loại nấm trên thiết bị quan sát quân sự lớn hơn. Các nghiên cứu tương tự về số lượng, chủng loại nấm trên bề mặt kính khác nhau cũng tăng lên tại các điểm lấy mẫu có độ ẩm cao [3].

Ngoài ra, các thiết bị quan sát quân sự trên có thời gian sản xuất ở các thời điểm khác nhau và nguồn gốc từ các nước khác nhau không thể sự khác biê ̣t về số lượng chủng nấm trên các mẫu.

3.2. Đặc trƣng nấm sợi gây phá hủy thiết bị quan sát ở các miền khí hậu

3.2.1. Đặc trƣng nấm sợi gây phá hủy chi tiết kính thiết bị quan sát tại Xuân Mai

Kết quả định danh nấm sợi theo hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và cuống sinh bào tử được thể hiện trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái các chủng nấm phân lập từ thiết bị quan sát

tại Xuân Mai

S T T Ký hiệu chủng Mô tả đặc điểm hình thái Loại mẫu

Hình thái khuẩn lạc Hình thái cuống sinh bào tử

Định tên theo hình thái

1 B01

Khuẩn lạc có D = 3,0 cm, xanh sẫm viền trắng bên ngoài, bào tử mịn MB1 Penicillium sp. 2 B02 Khuẩn lạc có D = 5,0 cm, màu vàng, bào tử mịn, về già chuyển vàng đậm

MB1 Paecilomyces

3 B03

Khuẩn lạc có D = 5,0 cm, màu xanh cỏ úa, bào tử đính MB3 Aspergillus flavus 4 B04 Khuẩn lạc có D= 2,7 cm mọc lan, màu vàng. MB2 Paecilomyces sp. 5 B05

Khuẩn lạc ghi, sợi ngắn, D = 5,0 cm, mọc lồi mặt thạch MB2 Curvularia sp. 6 B06 Khuẩn lạc trắng, có D = 5,0 cm, mọc lan MB2 Chưa xác định 7 B07

Khuẩn lạc xanh, D = 2,0 cm, bào tử mịn về già

chuyển màu xanh sẫm MB3 ; MB5 Penicillium sp. 8 B08 Khuẩn lạc có D = 0,5 cm, màu xanh, bào tử mịn, có giọt tiết khi về già

MB4 Penicillium

9 B09 Khuẩn lạc có D = 0,7 cm, màu xanh mi ̣n , viền trắng MB1 ; MB3 Aspergillus sp. 10 B10 Khuẩn lạc có D = 5,0 cm, về già lan tròn đều cả mặt thạch, màu đen, bào tử mịn.

MB5 Aspergillus

niger

11 B13

Khuẩn lạc D = 1,5 cm, sau già ngả vàng, bào tử mịn ở giữa MB1 ; MB3 Aspergillus sp. 12 B14

Khuẩn lạc ghi, sợi dài, D = 4,5 cm, sợi bông mặt thạch MB3 Curvularia sp. 13 B15

Khuẩn lạc màu trắng có D = 1,0 cm, về già hơi ngả vàng, bào tử mịn MB4 ; MB5 Penicillium sp. 14 B16 Khuẩn lạc có D = 0,7 cm, màu