2.3.2.1. Chuẩn bị vật liệu chuyển gen
Vật liệu được sử dụng để làm thể nhận gen là lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên:
Dùng dao tách lá mầm 10 - 14 ngày tuổi làm hai mảnh, sau đó sử dụng đầu kim nhọn gây tổn thương vào phần nách lá mầm.
Đoạn thân được cắt nhỏ với kích thước 0,3 - 0,5cm, chẻ dọc phần đọan thân mang mắt chồi bên ở phía trên và gây tổn thương bằng đầu kim nhọn.
2.3.2.2. Xác định mật độ tế bào A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn
Cấy trải A. tumefaciens cất giữ trong glycerol lên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung kanamycin 50 mg/l và rifamicin 50 mg/l, nuôi ở 28oC trong 48 - 96 giờ. Sau đó, lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin và nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở 28oC trong 16 - 18 giờ. Lấy 1ml dịch vi khuẩn nuôi hoạt hóa trong 10ml LB lỏng ở tốc độ 220 vòng/phút ở 28oC trong 3 - 4 giờ. Lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy lần 2 ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút, ở 4oC trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môi trường 1/2 MS và pha loãng cho tới mật độ tế bào vi khuẩn OD600nm là 0,6; 0,8 và 1,0.
Lá mầm và đoạn thân được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100µM, trong 30 phút sau đó thấm khô, cấy trên môi trường môi trường đồng nuôi cấy: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 3,9g/l + muối B5 0,3g/l + acetosyringone 100µM. Nuôi trong tối 3 ngày ở 25oC [13].
Phân tích sự biểu hiện gen gus tạm thời của các mẫu chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy theo phương pháp của Jefferson và cs (1987) [22]. Mẫu thực vật (lá mầm, đoạn thân) sau khi đồng nuôi cấy 3 ngày được nhuộm với dung dịch 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucoronide (X-gluc) 24 - 48 giờ trong tối ở nhiệt độ 370C, sau đó rửa bằng cồn 70% (cho đến khi loại bỏ hết diệp lục) và quan sát dưới kính hiển vi. Những vùng có gen gus nhuộm màu xanh chàm (gọi là mẫu dương tính). Tỉ lệ biểu hiện gen gus tạm thời được tính theo công thức:
Số mẫu dương tính khi nhuộm X-gluc
Tỉ lệ biểu hiện gen gus tạm thời = x 100 (%) Tổng số mẫu biến nạp
2.3.2.3. Xác định nồng độ acetosyringone (AS) phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn
Các bước nghiên cứu được tiến hành giống như các bước trong mục 2.3.2.2 nhưng chỉ khác là dung dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens được bổ sung chất dẫn dụ vi khuẩn AS với ba nồng độ 100M; 150M và 200M.
2.3.2.4. Xác định thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn
Các bước nghiên cứu được tiến hành giống như các bước trong mục 2.3.2.2 với mật độ vi khuẩn và nồng độ chất cảm ứng AS đã được tối ưu ở mục 2.3.2.2 và 2.3.2.3. Chỉ khác là lá mầm và đoạn thân được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn với thời gian là 10 phút, 20 phút và 30 phút.
2.3.2.5. Xác định nồng độ kanamycin (Km) thích hợp để chọn lọc chồi chuyển gen
Để đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ chất chọn lọc kanamycin đến khả năng sinh trưởng, phát triển của chồi dừa cạn, các đoạn thân mang mắt tạo chồi bên (không chuyển gen) đã được nuôi trên môi trường có bổ sung các nồng độ Km khác nhau là 0 mg/l; 25 mg/l; 50 mg/l; 75 mg/l; 100 mg/l và 150 mg/l. Theo dõi tỉ lệ tạo chồi sau 2 tuần và tỉ lệ sống sót của chồi sau 4 tuần. Chọn ra các nồng độ Km phù hợp cho chọn lọc chồi chuyển gen.
Tiến hành chuyển gen gus thông qua vi khuẩn A. tumefaciens với mật độ vi khuẩn, nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian nhiễm khuẩn đã được tối ưu ở mục 2.3.2.2, 2.3.2.3 và 2.3.2.4 với cả hai loại vật liệu lá mầm và đoạn thân. Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy, được rửa bằng nước cất vô trùng. Sau đó ngâm mẫu trong dung dịch 1/2 MS có bổ sung cefotaxim 500mg/l trong 10 phút. Thấm khô mẫu và chuyển lên môi trường nuôi cấy có bổ sung các nồng độ Km thích hợp (vừa tiến hành ở thí nghiệm trên) để chọn lọc và tái sinh chồi chuyển
gen: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500mg/l.
Tiếp tục theo dõi tỉ lệ tạo chồi sau 2 tuần và tỉ lệ chồi sống sót sau 4 tuần. Từ đó chọn ra nồng độ Km tối ưu. Tỉ lệ tạo chồi và tỉ lệ chồi sống sót được tính theo công thức:
Tổng số mẫu tạo chồi
- Tỉ lệ tạo chồi = x 100 (%) Tổng số mẫu cấy
Tổng số chồi sống sót
- Tỉ lệ chồi sống sót = x 100 (%) Tổng số mẫu cấy
2.3.2.6. Tạo cây dừa cạn chuyển gen gus thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Tiến hành chuyển gen gus thông qua vi khuẩn A. tumefaciens với mật độ vi khuẩn, nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian nhiễm khuẩn, nồng độ kanamycin đã được tối ưu từ mục 2.3.2.2 đến 2.3.2.5 vào vật liệu chuyển gen thích hợp đã được xác định.
Sau 4 tuần, chuyển các mẫu tạo chồi lên môi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l để kéo dài chồi. Chồi đạt chiều cao 2 - 3cm được chuyển sang môi trường ra rễ (có bổ sung kanamycin) để tăng hiệu quả chọn lọc cây chuyển gen: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l [4].
Lấy ngẫu nhiên lá và rễ của cây dừa cạn tiến hành nhuộm hóa mô tế bào để kiểm tra sự biểu hiện bền vững gen gus trong cây dừa cạn chuyển gen theo phương pháp của Jefferson và cs (1987) [22]. Hiệu suất chuyển gen gus được tính theo công thức:
Số cây dương tính khi nhuộm X-gluc
Hiệu suất chuyển gen gus = x 100 (%) Tổng số mẫu biến nạp
2.3.2. Phương pháp tính toán và xử lí số liệu
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Số liệu được thu thập, sau đó được xử lý thông kế trên máy vi tính bằng phần mềm Excel với các giá trị X và SX theo Chu Hoàng Mậu (2008) [8].
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU