C n3 KẾT QUẢ
3.2. Số l ợng tế bào miễn dịc γδT tu đ ợc sau nuơi cấy
3.2.1. Số l ợng tế bào miễn dịc γδT t u đ ợc sau nuơi cấy của n ời tình nguyện khỏe mạnh
Mười mẫu máu của người tình nguyện khỏe mạnh được nuơi cấy tăng sinh trong mơi trường cĩ bổ sung zoledronate (5mM) và IL-2 (600IU/ml). Kết quả nuơi cấy được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Số lượng tế bào của nhĩm người tình nguyện khỏe mạnh sau nuơi cấy
Code Số lượng (ngày 0) Tỷ lệ sống Số lượng (ngày 14) Tỷ lệ sống C01 2,1 x 104 95% 2,0 x 108 95% C02 1,8 x 104 95% 1,9 x 108 92% C03 1,9 x 104 97% 2,3 x 108 92% C04 2,3 x 104 93% 2,1 x 108 91% C05 2,0 x 104 94% 3,9 x 108 96% C06 1,6 x 104 90% 3,8 x 108 94% C07 1,7 x 104 90% 4,3 x 108 96% C08 2,5 x 104 97% 2,6 x 108 99% C09 2,4 x 104 92% 3,4 x 108 90% C10 1,6 x 104 97% 4,1 x 108 92% TB 2,0 x 104 94% 3,0 x 108 93.7%
Một số hình ảnh tế bào tại trước và sau nuơi cấy hoat hĩa, tăng sinh được minh họa trong hình 3.4 và hình 3.5.
Hình 3.4: Hình ảnh tế bào của người khỏe mạnh C02 trước và sau nuơi cấy
A. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được trước nuơi cấy; B. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được sau nuơi cấy
A B
Hình 3.5: Hình ảnh tế bào của người khỏe mạnh C05 trước và sau nuơi cấy
A. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được trước nuơi cấy; B. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được sau nuơi cấy
Số lượng tế bào miễn dịch thu được tăng khoảng hơn 1000 lần sau 14 ngày nuơi cấy, đạt giá trị khoảng 3,0 x 109 tế bào tỷ lệ sống trung bình 93.7%. Kết quả phù hợp với yêu cầu số lượng của khối tế bào miễn dịch cần đạt sau 14 ngày nuơi cấy.
A B
3.2.2. Số l ợng tế bào miễn dịc γδT t u đ ợc sau nuơi cấy của bệnh nhân ung t p ổi
Mười mẫu bệnh nhân ung thư phổi được nuơi cấy trong mơi trường bổ sung zoledronate (5 mM) và IL-2 (600IU). Kết quả nuơi cấy được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Số lượng tế bào của nhĩm bệnh nhân ung thư phổi thu được sau nuơi cấy
Code Số lượng
(trước nuơi cấy)
Tỷ lệ sống Số lượng (sau nuơi cấy)
Tỷ lệ sống BN01 1,5 x 104 95% 1,5 x 108 91% BN02 1,8 x 104 94% 4,5 x 108 89% BN03 1,9 x 104 96% 1,1 x 108 92% BN04 1,2 x 104 95% 1,6 x 108 93% BN05 1,4 x 104 90% 4,8 x 108 97% BN06 2,4 x 104 98% 2,5 x 108 96% BN07 2,6 x 104 95% 2,8 x 108 90% BN08 1,9 x 104 92% 3,7 x 108 78% BN09 2,2 x 104 96% 3,2 x 108 90% BN10 2,7 x 104 97% 3,6 x 108 90% TB 1,96 x 104 94,8% 2,93 x 108 90,6%
Một số hình ảnh tế bào của bệnh nhân ung thư phổi tại ngày 0 và ngày 14 được minh họa trong hình 3.6 và hình 3.7. Số lượng tế bào miễn dịch thu được tăng khoảng 1500 lần sau 14 ngày nuơi cấy, đạt giá trị khoảng 2,93 x 108 tế bào, tỷ lệ sống đạt trên 90,6%. Kết quả phù hợp với yêu cầu của khối tế bào miễn dịch cần đạt sau 14 ngày nuơi cấy
Hình 3.6: Hình ảnh tế bào của bệnh nhân ung thư BN01 trước và sau nuơi cấ.
A. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được trước nuơi cấy; B. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được sau nuơi cấy
A B
Hình 3.7: Hình ảnh tế bào của bệnh nhân ung thư BN05 trước và sau nuơi cấy.
A. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được trước nuơi cấy; B. Hình ảnh và số lượng tế bào thu được sau nuơi cấy
3 3 Xác định tỷ lệ tế bào γδT tron quần thể tế bào t u đ ợc sau nuơi cấy
Bằng kỹ thuật đếm dịng chảy tế bào (Flow cytometry), tỷ lệ tế bào γδT cĩ thể được xác định bằng cách nhuộm với kháng thể kháng CD3, CD8, CD4. Quần thể tế bào γδT sẽ biểu hiện CD3+/CD8-/CD4- trên bề mặt tế bào. Từ đĩ chúng ta cĩ thể xác định được tỷ lệ của tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được trước và sau nuơi cấy.
A B
3 3 Xác định tỷ lệ tế bào γδT tron quần thể tế bào sau nuơi cấy của n ời khỏe mạnh
Mười mẫu tế bào người khỏe mạnh trước và sau nuơi cấy được xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào bằng kỹ thuật đếm dịng chảy tế bào (Flow cytometry). Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 và minh họa trong hình 3.8.
Bảng 3.5: Tỷ lệ tế bào γδT của người tình nguyện khỏe mạnh trước và sau nuơi cấy
Mẫu Tỷ lệ tế bào γδT (%)
Tr ớc nuơi cấy Sau nuơi cấy
C01 5,8% 78% C02 6,3% 76% C03 4,15% 79% C04 5,73% 71% C05 5,5% 77% C06 6,65% 82% C07 5,1% 83% C08 5,12% 79% C09 7,5% 85% C10 6,8% 84%
Hình 3.8: Kết quả đếm dịng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu C02
A. Hình ảnh đếm dịng chảy tế bào trước nuơi cấy; B. Hình ảnh đếm dịng chảy tế bào sau nuơi cấy;
Các mẫu tế bào của người khỏe mạnh trước nuơi cấy cĩ tỷ lệ tế bào γδT khoảng 5-7%. Số liệu này phù hợp với tỷ lệ tế bào γδT cĩ trong máu ngoại vi của cơ thể. Sau 14 ngày nuơi cấy, ở tất cả các mẫu nuơi cấy đều cĩ tỷ lệ tế bào γδT đạt trên 79,4% (Hình 3.8A và B). Biểu hiện của gene mã hĩa cho thụ thể bề mặt Vγ9 - thụ thể đặc trưng cho tế bào γδT cũng cho thấy gen Vγ9 biểu hiện mạnh ở tế bào γδT sau nuơi cấy, gần như khơng biểu hiện trên dịng tế bào αβT sau nuơi cấy hoạt hĩa, tăng sinh (Hình 3.8C). Kết quả này cho thấy các mẫu người khỏe mạnh đáp ứng tốt với điều kiện nuơi cấy hoạt hĩa tế bào γδT.
Máu ngoại vi của người tình nguyện khỏe mạnh được thu thập và phân lập tế bào miễn dịch. Sau khi phân lập, số lượng tế bào miễn dịch thu được đạt trung bình 5 x 106 tế bào, tỷ lệ sống đạt trung bình 94%, trong đĩ tỷ lệ tế bào γδT chiếm 6%. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu đã cơng bố trước đây.
Tế bào miễn dịch sau phân lập được nuơi cấy trong mơi trường cĩ bổ sung 5 mM zoledronate và 600 IU/ml IL-2 để hoạt hĩa, tăng sinh tế bào γδT. Sau 15 ngày nuơi cấy, số lượng tế bào thu được đạt 3,0 x 108, tỷ lệ sống trung bình 93,7%, trong đĩ, tế bào γδT chiếm trung bình 80%. Kết quả này cho thấy, số lượng tế bào γδT đã tăng sinh gấp 1500 lần so với ngày đầu nuơi cấy. Kết quả này cĩ cao hơn khá rõ rệt so với những nghiên cứu trước đây khi nuơi cấy tăng sinh tế bào γδT, sử dụng biphosphonate và cytokine [117]. Sự khác biệt này cĩ thể xảy ra do cĩ sự khác nhau trong việc sử dụng biphosphonate khác nhau cũng như nồng độ của cytokine được sử dụng trong nghiên cứu.
Trong quần thể tế bào thu được gần như hồn tồn là tế bào lympho T, đặc biệt là tế bào γδT. Tế bào T độc và T trợ giúp chỉ chiếm khoảng 10 - 15%, tế bào NK chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ (5,9%) và hồn tồn khơng thấy sự xuất hiện của tế bào lympho B trong quần thể tế bào sau 14 ngày nuơi cấy bằng mơi trường cĩ bổ sung zoledronate và IL-2. Kết quả này chứng tỏ điều kiện nuơi cấy, hoạt hĩa, tăng sinh tế bào γδT từ máu ngoại vi đã được chuẩn hĩa tốt.
3 3 2 Xác định tỷ lệ tế bào γδT tron quần thể tế bào sau nuơi cấy của bệnh n ân un t phổi
Mười mẫu tế bào bệnh nhân ung thư phổi trước và sau nuơi cấy xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào bằng kỹ thuật đếm dịng chảy tế bào (Flow cytometry). Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 và minh họa trong hình 3.9.
Bảng 3.6: Tỷ lệ tế bào γδT của bệnh nhân ung thư phổi trước và sau nuơi cấy
Mẫu Tỷ lệ tế bào γδT
Tr ớc nuơi cấy Sau nuơi cấy
BN01 5,1% 81% BN02 6,2% 83% BN03 5% 86% BN04 6,3% 87% BN05 6,4% 84% BN06 6,2% 82% BN07 6,1% 83% BN08 5,8% 80% BN09 6,5% 85% BN10 5,8% 81%
Hình 3.9: Kết quả đếm dịng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu BN06
A. Hình ảnh đếm dịng chảy tế bào trước nuơi cấy; B. Hình ảnh đếm dịng chảy tế bào sau nuơi cấy;
Các mẫu tế bào của bệnh nhân ung thư phổi trước nuơi cấy cĩ tỷ lệ tế bào γδT khoảng 5-7%. Số liệu này phù hợp với tỷ lệ tế bào γδT cĩ trong máu ngoại vi của cơ thể. Sau 14 ngày nuơi cấy, ở tất cả các mẫu nuơi cấy đều cĩ tỷ lệ tế bào γδT đạt trên 80%, trung bình đạt 83,2% (Hình 3.9A và B). Biểu hiện của gene mã hĩa cho thụ thể bề mặt Vγ9 - thụ thể đặc trưng cho tế bào γδT cũng cho thấy gen Vγ9 biểu hiện mạnh ở tế bào γδT sau nuơi cấy, gần như khơng biểu hiện trên dịng tế bào αβT sau nuơi cấy hoạt hĩa, tăng sinh (Hình 3.9C) Kết quả này cho thấy các mẫu bệnh nhân ung thư đáp ứng rất tốt với điều kiện nuơi cấy hoạt hĩa, tăng sinh tế bào γδT.
Với những kết quả thu được trên mẫu người tình nguyện, quy trình phân lập, nuơi cấy hoạt hĩa, tăng sinh tế bào lympho từ máu ngoại vi được áp dụng trên bệnh nhân phổi.
Số lượng tế bào bạch cầu tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư phổi trung bình là 1,96 x 104, tương đương với nhĩm người tình nguyện.
Điều này được giải thích do tất cả các bệnh nhân trong nghiên cứu đều đang trong giai đoạn bệnh ổn định và chưa hoặc dừng điều trị bằng phĩng xạ hay hĩa chất. Tất cả các mẫu đều đạt tỷ lệ sống của tế bào trên 90%, trung bình 94,8%. Kết quả trên tương đồng với những nghiên cứu tăng sinh hoạt hĩa tế bào γδT sử dụng biphosphonate kết hợp với cytokine đã được cơng bố trước đây. Burjanadze M. và cộng sự (2007) sử dụng phosphotism hoặc zoldronate kết hợp với IL-2 để nuơi cấy hoạt hĩa và tăng sinh γδT trên bệnh nhân u tủy. Sau 14 ngày nuơi cấy, 88% tế bào thu được là γδT, số lượng tế bào γδT đạt 2,5 x 106
tế bào, mức độ tăng sinh gấp 300 lần so với ngày đầu nuơi cấy [12]. Tương tự với nghiên cứu này, Kondo và cs (2011) cũng sử dụng 5 mM zoledronate và 1000 IU/ml IL-2, thu được 93,8% tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được, sau 14 ngày nuơi cấy, với số lượng tế bào thu được 2,2 x 108 tế bào, tăng 1375 lần so với ngày đầu nuơi cấy [60]. Yoshimasa T. và cs (2018) đã sử dụng PTA thay cho zoledronate để hoạt hĩa, tăng sinh tế bào γδT trên tế bào ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt. Kết quả cho thấy sử dụng PTA, thu được số lượng tế bào đạt 5,6 x 108 tế bào, trong đĩ 95,6% là tế bào γδT, tăng gấp 7085 lần so với ngày đầu nuơi cấy [119]. So sánh với các nghiên cứu tương tự trên
thế giới cho thấy quy trình phân lập, hoạt hĩa tăng sinh tế bào γδT áp dụng trong nghiên cứu này cĩ hiệu quả tương đương và chất lượng đảm bảo để thực hiện những nghiên cứu tiếp theo.
3 4 Đán iá mức độ hoạt hĩa và hoạt tính của tế bào miễn dịc γδT sau nuơi cấy cấy
Mức độ hoạt hĩa của tế bào miễn dịch γδT được đánh giá thơng qua khả năng tiết các cytokine như IFNγ, TNFα cũng như khả năng gây độc cho tế bào ung thư. Khả năng tiết cytokine của tế bào được xác định bằng kỹ thuật Realtime PCR (với mức độ mRNA) và ELISA (với mức độ protein). Trong khi đĩ, khả năng gây độc cho tế bào ung thư của tế bào γδT sẽ được xác định bằng phương pháp đo hoạt tính gây độc cho tế bào.
3.4.1. Khả năn tiết IFNγ của tế bào γδT vào mơi tr ờng nuơi cấy sau hoạt ĩa, tăn sin
Ở mức độ RNA, biểu hiện của mRNA IFNγ được xác định bằng kỹ thuật Realtime PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen IFNγ. Kết quả được đưa ra trong bảng 3.7 và hình 3.10.
Bảng 3.7: Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trước và sau nuơi cấy
STT Mã BN Tr ớc nuơi cấy Sau nuơi cấy ΔΔCt 2-ΔΔCt Ct β-
actin
Ct IFNγ Ct β-actin Ct IFNγ
Mẫu chứng 1 C01 15,2 28,5 15,6 26,8 -2,1 4,28 2 C02 15 28,6 15,5 26,6 -2,5 5,65 3 C03 15,4 28,7 15,7 26,5 -2,5 5,65 4 C04 15,2 28,4 15,9 26,9 -2,2 4,59 5 C05 15,9 28,5 15,4 26,9 -1,1 2,14 6 C06 15,2 28,4 15,4 26,6 -2,0 4.0 7 C07 15,6 28,5 15,8 27 -1,7 3.24
8 C08 15,4 28,1 15,1 26,3 -1,5 2.82 9 C09 15,9 28,9 16,1 26,7 -2,4 5.27 10 C10 15,2 28,5 15,8 26,9 -2,2 4.59 TB 4.22 Mẫu bệnh 11 BN01 16,2 29,6 16,5 28,1 -1,8 3,48 12 BN02 16,4 29,4 16,6 29,7 -1,7 3,24 13 BN03 16,8 29,5 16,5 28,2 -1,0 2,0 14 BN04 16,5 29,6 16,9 28,4 -1,6 3,03 15 BN05 16,2 29,5 16,5 28,1 -1,7 3,24 16 BN06 16,6 28,9 16,3 27,5 -1,1 2,14 17 BN07 16,8 30,2 16,5 29,1 -0,8 1,74 18 BN08 16,4 30,1 16,6 29,5 -0,8 1,74 19 BN09 17 29 17,2 29,7 0,5 0,71 20 BN10 16,5 29,4 16,8 28,3 -1,4 2,64 TB 2,40
Hình 3.10: Mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trên tế bào γδT trước và sau nuơi cấy; *: p < 0,05
Sau 14 ngày nuơi cấy hoạt hĩa, tăng sinh, mức độ biểu hiện của gen IFNγ trên tồn bộ 10 mẫu người khỏe mạnh đều tăng trung bình 4,22 lần so với ngày đầu tiên, cao nhất đạt tới 5,67 lần. Tương tự, ở 9/10 mẫu tế bào sau nuơi cấy của bệnh nhân ung thư phổi cũng quan sát thấy sự tăng biểu hiện của gen IFNγ, trung bình đạt 2,40 lần so với ngày đầu nuơi cấy. Tất cả các kết quả đều cĩ ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Kết quả này cho thấy sau 14 ngày nuơi cấy, tế bào γδT cĩ biểu hiện gen IFNγ tăng rõ rệt so với ngày đầu nuơi cấy.
Để làm rõ hơn khả năng thực hiện chức năng miễn dịch của khối tế bào γδT thu được sau nuơi cấy, kỹ thuật ELISA được thực hiện nhằm đo nồng độ protein IFNγ do khối tế bào γδT tiết ra mơi trường nuơi cấy. Mơi trường nuơi cấy tế bào
trong ngày đầu tiên (ngày 0) và ngày thu hoạch (ngày 14) được thu lại để đo nồng độ IFNγ do tế bào γδT tiết ra. Kết quả được nêu trong bảng 3.8 và hình 3.11.
Bảng 3.8: Nồng độ IFNγ trước và sau nuơi cấy hoạt hĩa (pg/ml)
Mẫu chứng Tr ớc nuơi cấy Sau nuơi cấy
C01 61,83 1793,69 C02 30,80 1417,48 C03 45,45 1717,61 C04 96,62 1929,30 C05 60,00 1501,56 C06 50,23 1547,88 C07 94,52 1625,36 C08 123,20 1526,47 C09 72,56 1758,42 C10 48,96 1685,26 TB 68,42 1650,30
Mẫu bệnh Tr ớc nuơi cấy Sau nuơi cấy
BN01 91,51 1025,36 BN02 62,89 989,69 BN03 42,72 963,25 BN04 110,92 1416,56 BN05 113,27 1962,47 BN06 82,52 1029,58 BN07 74,74 1010,36 BN08 56,52 1002,34 BN09 95,25 1536,49 BN10 62,37 1236,75 TB 79,27 1217,29
Hình 3.11: Nồng độ IFNγ trong mơi trường tế bào trước và sau nuơi cấy; *: p < 0.05
Nồng độ IFNγ do tế bào miễn dịch tiết vào mơi trường nuơi cấy sau 14 ngày nuơi cấy hoạt hĩa, tăng sinh cao hơn rõ rệt so với ngày đầu, đạt trung bình 1217,29 pg/ml, so với trung bình 79,27 pg/ml trong mơi trường nuơi cấy của ngày đầu tiên.
Zoledronate cĩ khả năng gây tích lũy Isopentenyl pyrophosphate (IPP), sản phẩm trung gian của con đường mevalonate, dẫn đến hoạt hĩa tế bào γδT phụ thuộc thụ thể TCR, gây ra đáp ứng nhanh đối với tế bào chuyển dạng ác tính nội sinh, như