a. Nhuộm kháng thể Vimentin:
* Mục đích: Quan sát sự hiện diện của xơ Vimentin trong tế bào não giữa phôi cũng như các tế bào sau nuôi cấy
Các bước tiến hành: * Chuẩn bị mẫu: o Với mô não giữa
- Cố định bằng PFA 4% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng;
- Ngâm sucrose 20% qua đêm ở 4℃ để mô chìm xuống đáy dung dịch; - Đúc block OCT (Tissue Teck, Nhật Bản);
- Đông lạnh ở nhiệt độ -20℃ đến -80℃; - Cắt lát 5 - 10µm bằng máy cắt lạnh; - Để mẫu khô 30 phút ở nhiệt độ phòng; o Với tế bào nuôi cấy
- Cố định tế bào nuôi cấy bằng PFA 4% trong 30 phút ở nhiệt độ phòng * Nhuộm tế bào
(1) Rửa PBS 0,1M 10 phút/lần trong 3 lần;
(2) Hoạt hóa kháng nguyên bằng dung dịch đệm natri citrate 0,1M, pH 6,0 ở 96°C trong 10 phút;
(3) Đưa lại nhiệt độ bình thường, chạy nước 10 phút;
(5) Block kháng nguyên không đặc hiệu bằng dung dịch 5% NGS, 0,1% Triton X-100, PBS 1X trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng;
(6) Nhuộm kháng thể 1: Vimentin (pha loãng 1/300) qua đêm ở 4℃; (7) Rửa PBS 0,1M 1h/lần trong 3 lần;
(8) Nhuộm kháng thể 2: huỳnh quang (Alexa Flour 546, pha loãng 1/200 trong 2h ở nhiệt độ phòng. Từ bước này tránh ánh sáng;
(9) Rửa PBS 0,1M 10 phút/ lần trong 3 lần
(10) Nhuộm nhân bằng Sytox green (pha loãng 1/10.000) trong 1 phút; (11) Rửa bằng PBS 0,1M 10 phút/lần trong 3 lần;
(12) Dán lamelle;
(13) Quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang vật kính x10; x20 và x40. b. Nhuộm kháng thể TH
* Mục đích: Quan sát sự hiện diện của enzym Tyrosine hydroxylase (TH) trong tế bào não giữa phôi cũng như các tế bào sau nuôi cấy.
* Các bước tiến hành:
Tương tự như nhuộm kháng thể Vimentin. Thay bước nhuộm kháng thể 1 bằng cách sử dụng kháng thể TH (pha loãng 1/750) qua đêm ở 4℃.
Các tiêu bản sau khi nhuộm cũng được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.