CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon trong
Mô hình thí nghiệm dung tích 50 lít và xử lý sơ bộ vật liệu mang được thiết kế như mục 2.2.3, triển khai tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường, viện Công nghệ sinh học vào tháng 6 năm 2016.
2.2.5.2. Tạo biofilm trên vật liệu mang
Tiến hành tạo biofilm trên vật liệu mang theo mô tả ở mục 2.2.3 ở thời gian mật độ vi sinh vật trên vật liệu đạt cao nhất. Tiếp đó hút nhẹ hết dịch môi trường nuôi cấy và rửa nhẹ vật liệu mang bằng nước cất trong 2 lần để loại bỏ các vi sinh vật ở dạng tự do.
2.2.5.3. Vận hành mo hình thí nghiệm
Bổ sung 50 lít nước thải nhiễm dầu đã pha loãng vào mô hình và vận hành hệ thống đảo trộn và sục khí để biofilm vi sinh vật tiến hành phân hủy các thành phần hydrocarbon trong nước thải.
Thí nghiệm đối chứng được thực hiện bằng cách bổ sung 50 lít nước thải nhiễm dầu ở cùng nồng độ pha loãng trong mô hình có vật liệu mang nhưng không có vi sinh vật.
Hình 2.4. Mô hình thí nghiệm dung tích 50 lít
Hình 2.5. Mô hình thí nghiệm đối chứng dung tích 50 lít
2.2.5.4. Xác định hàm lượng các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu
Hàm lượng các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu được xác định sau 3, 5 và 7 ngày xử lý bằng các biện pháp phân tích hóa học theo tiêu chuẩn TCVN 5070:1995, GC, GSMC và HPLC. Mỗi mẫu phân tích được lặp lại 3 lần.
2.2.6. Đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu của biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang ở quy mô 300 lít
tốt nhất và đem lại hiệu quả xử lý các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu cao nhất để tiếp tục đánh giá khả năng xử lý nước thải nhiễm dầu ở hệ thống 300 lít.
2.2.6.1. Xử lý sơ bộ vật liệu mang
Vật liệu mang được xử lý sơ bộ như mục 2.2.3. Vật liệu được cắt thành các tấm có kích thước 85*85*15cm.
2.2.6.2. Thiết kế hệ thống 300 lít thí nghiệm
Hệ thống 300 lít được triển khai thí nghiệm theo 2 nguyên lý là xử lý theo mẻ và xử lý liên tục để đáp ứng các yêu cầu khác nhau trong xử lý nước thải nhiễm dầu trong thực tế.
a, Hệ thống xử lý theo mẻ
Hệ thống được thiết kế theo nguyên lý xử lý theo mẻ áp dụng kỹ thuật biofilm tầng tĩnh được mô tả bởi Burghate & Ingole [102] với dung lượng 300 lít/mẻ được triển khai tại Trại thực nghiệm sinh học, Cổ Nhuế - Hà Nội vào tháng 7 năm 2016. Hệ thống gồm 3 bộ phận chính: bể xử lý, hệ thống bơm tuần hoàn và hệ thống phân phối khí.
Bể xử lý: kích thước 100*100* 50cm (dài*rộng*cao), dung tích vận hành 300 lít. Trong mỗi bể xử lý được lắp đặt các module vật liệu mang kích thước 85*85*15cm (dài*rộng*cao). Tỷ lệ thể tích vật liệu mang: dung tích vận hành bể xử lý là 1:5.
Hệ thống bơm tuần hoàn: Hệ thống bơm tuần hoàn bao gồm máy bơm lifetech AP 3100 và đường ống PVC phi 21, hút chất lỏng từ đáy bể và phân phối đều lên trên bề mặt hệ thống màng sinh học. Lưu lượng đảo trộn là 1350 lít/h.
Hệ thống phân phối khí: Hệ thống phân phối khí sử dụng máy nén khí. Mỗi bể được bố trí 6 đĩa phân phối khí RSD 270mm, lưu lượng không khí 100 lít/phút/đĩa.
b, Hệ thống xử lý liên tục
Hệ thống được thiết kế theo nguyên lý xử lý liên tục áp dụng kỹ thuật biofilm tầng tĩnh được mô tả bởi Burghate & Ingole [102] với dung lượng 300 lít/ngày được triển khai tại Viện Công nghệ Sinh học vào tháng 7 năm 2016. Hệ thống gồm 5 bộ phận chính: hệ thống cấp đầu vào, bể xử lý, hệ thống bơm tuần hoàn, hệ thống phân phối khí và bồn chứa nước đầu ra.
Hình 2.6. Cấu tạo hệ thống xử lý 300 lít/ngày
Hệ thống cấp đầu vào: bao gồm bồn chứa nước thải nhiễm dầu bằng nhựa và máy bơm. Nước thải được cấp từ bồn chứa vào bể xử lý bằng máy bơm định lượng Cheonsei KS-22-PTC-HWS-S.
Bể xử lý: bao gồm 02 bể có kích thước 1,5*1*1,2m (dài*rộng*cao), dung tích vận hành 1,5m3/bể. Bể được cấu tạo bằng inox SS304 chống ăn mòn. Trong mỗi bể xử lý được lắp đặt các module vật liệu mang kích thước 85*85*15cm (dài*rộng*cao). Tỷ lệ thể tích vật liệu mang: dung tích vận hành bể xử lý là 1:5.
Hệ thống bơm tuần hoàn: Hệ thống bơm tuần hoàn bao gồm máy bơm lifetech AP 3100 và đường ống PVC phi 21, hút chất lỏng từ đáy bể và phân phối đều lên trên bề mặt hệ thống màng sinh học. Lưu lượng đảo trộn là 1350 lít/h.
Hệ thống phân phối khí: Hệ thống phân phối khí sử dụng máy nén khí Wing TM 0.1/8. Mỗi bể được bố trí 6 đĩa phân phối khí RSD 270mm, tổng lưu lượng không khí 100 lít/phút.
(c)
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí hệ thống module vật liệu mang, đĩa phân phối khí trong bể xử lý (a,c) và cấu tạo khung giữ vật liệu mang (b)
1 Dây phi 3, khung lưới 4 Ecu M8, long đen,vênh, inox
2 Tai định vị (trượt trong hèm) 5 Bulong M8, dài 115, inox 3 Miếng tăng cứng góc lỗ phi 9 6 Hộp 10x10, inox, làm khung
2.2.6.3. Tạo biofilm trên vật liệu mang
Các chủng vi khuẩn và nấm men được nuôi lỏng, lắc trong môi trường HKTS đối với vi khuẩn và Hansen đối với nấm men ở 30 và 37oC trong 18h. Tiếp đó tiến hành ly tâm thu sinh khối tế bào ở 6000 vòng/phút đối với vi khuẩn và 4000 vòng/phút đối với nấm men trong 10 phút, 4oC. Sinh khối được rửa bằng nước cất vô trùng 2 lần, rồi hòa tan trong 1 lít nước muối sinh lý vô trùng. Tiến hành bổ sung dịch sinh khối vi sinh vật và môi trường hỗn hợp HKTS:Hansen (6:4) vào mô hình sao cho được tổng thể tích 50 lít và giá trị OD600 là 0,3. Nuôi trong nhiệt độ phòng, sục khí liên tục trong 24h. Tiếp đó bổ sung dịch sinh khối vi sinh vật và môi trường HKTS:Hansen (6:4) vào bể xử lý sao cho được tổng thể tích 1500 lít và giá trị OD600 là 0,3. Nuôi tĩnh tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển tạo biofilm trên vật liệu mang. Sau khi biofilm có mật độ vi sinh vật đạt yêu cầu, tiến hành hút dịch nuôi và rửa nhẹ module vật liệu bằng nước cất.
2.2.6.4. Vận hành hệ thống xử lý
Hệ thống xử lý theo mẻ: cấp 300 lít nước thải nhiễm dầu vào bể xử lý và vận hành các hệ thống đảo trộn và sục khí. Thí nghiệm đối chứng được thực hiện trên bể xử lý không bổ sung vi sinh vật tạo biofilm trên vật liệu.
Hệ thống xử lý liên tục: Vận hành hệ thống xử lý với dung lượng cấp vào 1,25 l/h (300l/ngày). Các hệ thống đảo trộn và sục khí được vận hành để tăng cường khả năng xử lý của biofilm. Thí nghiệm đối chứng được thực hiện trên
cùng hệ thống, tuy nhiên không bổ sung vi sinh vật tạo biofilm trên vật liệu.
2.2.6.5. Xác định hàm lượng các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu
Hàm lượng các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu được xác định sau 5, 7 và 14 xử lý bằng các biện pháp phân tích hóa học theo tiêu chuẩn TCVN 5070:1995, GC, GSMC và HPLC. Mỗi mẫu phân tích được lặp lại 3 lần.
2.2.7. Đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon trong nước thảinhiễm dầu của biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang ở quy mô 20m3 nhiễm dầu của biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang ở quy mô 20m3
Biofilm các chủng vi sinh vật trên vật liệu mang phù hợp tiếp tục được đánh giá khả năng xử lý các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu tại kho xăng dầu Đỗ Xá, Thường Tín, Hà Nội. Thời gian thực hiện trong tháng 5 năm 2019.
2.2.7.1.Xử lý sơ bộ vật liệu mang
Vật liệu mang được xử lý sơ bộ như mục 2.2.3. Vật liệu được cắt thành các tấm có kích thước 120*100*20cm.
2.2.7.2. Thiết kế hệ thống xử lý
Hệ thống xử lý được thiết kế xử lý theo mẻ với dung tích 20m3/mẻ theo nguyên lý kỹ thuật biofilm tầng tĩnh được mô tả bởi Burghate & Ingole [102]. Hệ thống bao gồm 05 bộ phận chính: Bể xử lý, các module vật liệu mang, hệ thống đảo trộn, hệ thống cấp khí và bể khử trùng.
Hình 2.8. Mô hình xử lý 20m3/mẻ
Bể xử lý: Bể xử lý được thiết kế bằng bê tông chống thấm đặt chìm dưới lòng đất, kích thước bể 6,8*3*1,5m, dung tích vận hành 20m3.
Module vật liệu mang: Trong bể xử lý được đặt 20 module vật liệu mang. Mỗi module được thiết kế bao gồm khung module và vật liệu mang với kích thước
120*100*20cm. Khung module được cấu tạo từ inox không gỉ SS304, trên khung được bố trí đường cấp khí và đĩa phân phối khí để cung cấp khí cho biofilm vi sinh vật trong quá trình xử lý. Vị trí đặt vật liệu mang được bao ngoài bằng lưới inox không gỉ để cố định vật liệu bên trong.
(a) (b)
Hình 2.9. Cấu tạo khung module (a) và module vật liệu mang (b)
Hệ thống đảo trộn: Hệ thống đảo trộn sử dụng máy bơm Pedrollo NGA 1A với lưu lượng đảo trộn là 12.000 lít/h. Hệ thống cấp khí sử dụng máy nén khí, cấp không khí thông qua đĩa phối khí RSD 270mm, lưu lượng không khí 100 lít/phút/đĩa.
2.2.7.3. Tạo biofilm trên vật liệu mang
Việc tạo biofilm trên vật liệu mang được triển khai trên các bể 1,5m3. Phương pháp tiến hành được thực hiện như mô tả tại mục 2.2.5.3.
2.2.7.4. Vận hành hệ thống
Vật liệu mang sau khi được tạo biofilm được lắp đặt vào các module trong bể xử lý. Nước thải nhiễm dầu tại kho xăng dầu được xử lý bằng hệ thống tuyển nổi trước khi đưa vào hệ thống xử lý sinh học.
Hệ thống xử lý được vận theo mẻ 20m3/mẻ. Trong quá trình xử lý được đảo trộn và cấp khí liên tục. Nước thải sau khi xử lý đạt yêu cầu QCVN 40:2011/BTNM, được chuyển sang bể khử trùng bằng chlorine và để lắng 2 ngày trước khi xả ra ngoài môi trường
Thí nghiệm đối chứng được thực hiện trên cùng hệ thống với các module vật liệu mang không được bổ sung vi sinh vật tạo biofilm.
2.2.7.5. Xác định hàm lượng các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu
định sau 5 ngày, 7 ngày và 14 xử lý bằng các biện pháp phân tích hóa học theo tiêu chuẩn TCVN 5070:1995, GC, GSMC và HPLC. Mỗi mẫu phân tích được lặp lại 3 lần.
2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU3.1. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật 3.1. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật
Sáu chủng vi khuẩn và bốn chủng nấm men được nuôi cấy trên các ống eppendorf và theo dõi khả năng hình thành biofilm sau 24h. Khả năng tạo biofilm được đánh giá bằng việc bắt màu tím tinh thể và độ hấp phụ của tím tinh thể tại bước sóng 570nm, kết quả được trình bày ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật
So với chủng Acinetobacter calcoaceticus P23 là đối chứng dương (OD570
đạt 11,04), các chủng Acinetobacter sp. QN1 và Bacillus sp. B8 cho khả năng hình thành biofilm ở mức khá tốt sau 24h nuôi cấy, chỉ số OD570 đạt từ 9,58 đến 12,06. Đặc biệt 05 chủng Debaryomyces sp. BN5, Serratia sp. DX3, Debaryomyces sp. QNN1, Debaryomyces sp. QN5 và Trichosporon sp. B1 có khả năng hình thành biofilm rất tốt với OD570 đạt từ 15,23 đến 27,4. Hai chủng Bacillus sp. HY1 và
Rhodotorula sp. QNB3 có khả năng hình thành biofilm thấp nhất trong số các chủng thí nghiệm.
Bảy chủng vi sinh vật bao gồm 4 chủng vi khuẩn Acinetobacter sp. QN1,
Bacillus sp. B8, Debaryomyces sp. BN5, Serratia sp. DX3 và 3 chủng nấm men
Debaryomyces sp. QNN1, Debaryomyces sp. QN5, Trichosporon sp. B1 được lựa chọn để tiếp tục đánh giá tính đối kháng khi nuôi cấy chung trong các thí nghiệm tiếp theo. Chủng vi sinh vật P23 B1 DX3QNN1QN5QNB3HY1 BN5 B8 QN1 0 1.59 4.31 5 9.58 10 11.04 12.06 15 15.23 20 19.71 25 26.35 27.4 26.83 30 G ia tr i ∆ O D ́ 57 0
3.2. Tính đối kháng của các chủng vi sinh vật
Bảy chủng vi sinh vật lựa chọn được cấy trên các đĩa thạch sao cho mỗi chủng đều được cấy cắt nhau từng cặp. Sau 24h nuôi cấy các khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn và nấm men phát triển tốt trên môi trường MPA và Hanssen (Hình 3.2). Từ kết quả đạt được sau 24h ở Hình 3.2.a chúng ta có thể thấy được các chủng giống phát triển tốt, các đường ria rõ nét không có hiện tượng bị đứt đoạn hay không mọc. Điều đó chứng tỏ trong quá trình phát triển không xảy ra hiện tượng cạnh tranh hay ức chế sự phát triển lẫn nhau. Tuy nhiên tại Hình 3.2.b, tại đoạn cắt nhau giữa chủng Trichosporon sp. B1 và chủng Debaryomyces sp. QN5 xuất hiện sự không mọc của các khuẩn lạc của chủng Trichosporon sp. B1, đoạn cắt giữa chủng Trichosporon sp. B1 với chủng Acinetobacter sp. QN1 xuất hiện sự không mọc của các khuẩn lạc của chủng Acinetobacter sp. QN1, điều này cho thấy giữa chủng Trichosporon sp. B1 và 02 chủng Acinetobacter sp. QN1, Debaryomyces sp. QN5 có sự đối kháng nhau trong quá trình sinh trưởng. Qua đó, chúng tôi đã xác định được 06 chủng vi sinh vật bao gồm Acinetobacter sp. QN1, Bacillus sp. B8,
Debaryomyces sp. BN5, Serratia sp. DX3, Debaryomyces sp. QNN1 và
Debaryomyces sp. QN5 có khả năng tạo màng tốt và không có tính đối kháng lẫn nhau, thuận lợi cho các nghiên cứu tiếp theo khi sử dụng chung các chủng vi sinh vật này trong cùng một canh trường nuôi cấy.
Tại các bước thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi thiết lập các mô hình đánh giá hiệu quả xử lý nước ô nhiễm dầu của biofilm hỗn hợp 6 chủng vi sinh vật lựa chọn.
Hình 3.2. Tính đối kháng của các chủng vi sinh vật lựa chọn
(1: Acinetobacter sp. QN1; 2: Bacillus sp. B8; 3: Debaryomyces sp. BN5; 4:
Serratia sp. DX3; 5: Debaryomyces sp. QNN1; 6: Debaryomyces sp. QN5; 7: Trichosporon sp. B1)
3.3. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật trên vật liệu mang
Bốn loại vật liệu mang có những đặc tính phù hợp cho sự hình thành biofilm vi sinh vật, đây cũng là những loại vật liệu có giá thành rẻ và phổ biến tại Việt Nam. Hỗn hợp đa chủng vi sinh vật được thử nghiệm khả năng tạo biofilm trên các loại vật liệu mang lựa chọn nhằm tìm ra loại vật liệu mang phù hợp nhất để ứng dụng trong xử lý nước thải nhiễm dầu. Thí nghiệm đối chứng được triển khai trong mô hình không bổ sung vi sinh vật.
Các chủng vi sinh vật được tiến hành nuôi tĩnh trên mô hình 50 lít có gắn các module vật liệu mang. Sau 18, 24 và 36h nuôi cấy, bằng mắt thường có thể thấy môi trường vi sinh vật trong mô hình độ đục tăng dần do sự phát triển của hỗn hợp chủng vi sinh vật. Trên bề mặt vật liệu mang xuất hiện một lớp màng màu trắng chính là biofilm vi sinh vật được hình thành. Sau 18, 24 và 36h, mẫu vật liệu mang được thu thập và tiến hành xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp MPN, kết quả được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng tạo biofilm của vi sinh vật trên vật liệu mang
Vật liệu mang
CFU/cm3
18h 24h 36h
Biofilm ĐC Biofilm ĐC Biofilm ĐC
Sỏi nhẹ 6+2,6*107 0 4,35+4,08*1010 0 2,1+0,69*1012 6,6+3,16*102
Cellulose 3,45+0,94*107 0 2,25+0,78*108 0 4,25+0,9*109 4,5+1,56*102
Xơ dừa 9+4,5*108 0 2,55+0,52*1010 0 3,9+0,69*1012 4,5+1,56*102
Mút xốp 5,25+3,44*105 0 1,05+0,52*107 0 1,65+0,52*1010 5,7+3,64*102
Số lượng tế bào hỗn hợp chủng vi sinh vật trên các loại vật liệu mang đều đạt trên 109 CFU/cm3 sau 36h nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, trong đó số lượng vi sinh vật trên vật liệu mang xơ dừa tại tất cả các thời điểm kiểm tra đều cho kết quả cao nhất so với các loại vật liệu mang khác ở mức 9*108 sau 18h, 2,55*1010 sau 24h và 3,9*1012 sau