Sự hình thành và cấu trúc biofilm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.3. Màng sinh học và ứng dụng trong xử lý ô nhiễm dầu

1.3.1. Sự hình thành và cấu trúc biofilm

Cấu trúc màng sinh học vi sinh vật được phát hiện đầu tiên bởi van Leeuwenhoek trên bề mặt răng bằng việc sử dụng kính hiển vi. Phát hiện đầu tiên đã chứng minh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo cấu trúc biofilm trên bề mặt vật thể rắn. Các phát hiện sau này cho thấy biofilm là một cấu trúc phổ biến của vi khuẩn, một số loài vi nấm và vi sinh vật khác trong điều kiện sống tự nhiên, để chống lại các stress của môi trường cũng như cạnh tranh với các loài khác [41, 42].

Biofilm là một cấu trúc phức tạp được hình thành khi vi sinh vật thiết lập sự tồn tại của chúng trên bề mặt chất rắn. Quá trình hình thành biofilm có thể tóm tắt thành 3 giai đoạn chính (hình 1.1): bám dính, tăng sinh và hình thành cấu trúc biofilm. Giai đoạn đầu tế bào tự do vi sinh vật bám dính vào bề mặt nhờ các chất kết dính polysaccharide ngoại bào và các cấu trúc bên ngoài tế bào như lông nhung, roi, pili, giai đoạn này bị ảnh hưởng nhiều bởi đặc tính bề mặt chất rắn (tĩnh điện, độ gồ ghề…) và mật độ vi sinh vật được chuyển đến bề mặt [43].

Sau khi bám dính thành công, vi sinh vật tăng cường phân chia và sản sinh các polymer ngoại bào, khi đó các tế bào vi sinh vật sẽ được bao bọc trong một khối chất nền EPS và hình thành cấu trúc biofilm. Cấu trúc biofilm trải qua một thời gian sẽ đạt tăng trưởng cực đại và khi khả năng sản sinh chất nền bị hạn chế do đột biến, cấu trúc biofilm sẽ bị phân giải, các tế bào vi sinh vật bị tách ra khỏi cấu trúc trở lại trạng thái tự do [45].

Sự hình thành biofilm của vi sinh vật có thể được diễn ra trên tất cả các dạng bề mặt chất rắn như: nhựa, kim loại, kính, hạt đất, gỗ, vật liệu cấy ghép y tế, mô và các sản phẩm thực phẩm. Trong tự nhiên biofilm có thể hình thành với các dạng đơn chủng và đa chủng, tức là gồm nhiều chủng vi sinh vật khác nhau cộng sinh trong cấu trúc biofilm [43].

Một biofilm trong tự nhiên gồm 2 thành phần chính: Thành phần tế bào (tập hợp các tế bào của một hay nhiều loài vi sinh vật khác nhau, bám dính trên bề mặt nhất định) và mạng lưới các hợp chất ngoại bào EPS bao quanh các tế bào, tạo nên cấu trúc đặc trưng cho biofilm. Trong đó, khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm 2 – 5 % tổng khối lượng biofilm, 3 - 6% là các EPS và ion, còn lại là nước [46]. Trên 70% trọng lượng sinh khối khô của biofilm là chất nền EPS với thành phần chính là các polysaccharide ngoại bào. Chất nền EPS có vai trò rất lớn trong việc hình thành cấu trúc biofilm cũng như tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt của môi trường và các nhân tố đối kháng [47].

Hình 1.2. Cấu trúc biofilm [48]

Carbonhydrate và protein là những thành phần chính trong EPS, ngoài ra các thành phần như lipid, acid nucleic, acid uronic và một số hợp chất hữu cơ khác cũng được tìm thấy trong EPS [49]. Các hợp chất này thay đổi theo không gian và thời gian

tồn tại của biofilm. Về cơ bản biofilm càng dày và thời gian tồn tại càng lâu thì có hàm lượng EPS càng nhiều, thông thường một EPS có độ dày từ 0,2 đến 1 μm, ở một số loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS không vượt quá 10 đến 30 μm. Mật độ tế bào tập trung cao nhất ở lớp đỉnh của biofilm và giảm dần theo độ sâu nhưng thành phần EPS lại phong phú hơn ở vùng phía trong biofilm. Thành phần EPS trong hầu hết các biofilm cũng khác biệt so với các vi sinh vật ở dạng sống tự do. Mỗi thành phần trong EPS đều có chức năng riêng biệt giúp duy trì các hoạt động trong cấu trúc biofilm [50].

Các tế bào trong biofilm tồn tại dưới dạng các vi khuẩn lạc (colonization), các vi khuẩn lạc này cũng chính là đơn vị cấu trúc nên biofilm. Các vi khuẩn lạc đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm, đảm nhận chức năng tiết các polymer ngoại bào và sử dụng các yếu tố phụ trợ để giúp các tế bào khác bám dính vào. Thành phần này cũng tạo nên những đặc tính riêng biệt về biofilm của mỗi loài vi sinh vật [51].

Những nghiên cứu trước đây cho rằng, cấu trúc của biofilm bao gồm nhiều lớp mỏng được tạo thành từ ma trận các tế bào liên kết với nhau trên đó tạo thành. Bằng việc sử dụng kính hiển vi điện tử quét laser (Confocal Scanning Laser Microscopy) và các công cụ phân tích hình ảnh đã cho thấy cấu trúc biofilm có tổ chức, đặc thù và phản ánh các chức năng nhất định của biofilm [52]. Trong biofilm có các kênh vận chuyển có chức năng cung cấp nước, các chất dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn tại trong chúng và đem chất thải đi. Giữa các tế bào vi sinh vật diễn ra sự trao đổi thông tin liên tục đảm bảo cho biofilm được hình thành một cách chính xác, trao đổi thông tin liên tục giữa các tế bào. Biofilm có cấu trúc không đồng nhất, bao gồm nhiều lớp vi sinh vật hiếu khí bên trên và nhiều lớp vi sinh vật kỵ khí bên trong. Do các luồng nước chảy qua khuấy động nên các vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí song song tồn tại trong các hốc nhỏ phân bố khắp trong biofilm. Chiều dày của biofilm thay đổi từ một vài μm thậm chí đến vài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật, tuổi biofilm, lượng dinh dưỡng và áp lực dòng chảy [45].

1.3.2. Vai trò của biofilm đối với vi sinh vật

1.3.2.1. Bảo vệ khỏi các tác nhân từ môi trường

Mạng lưới EPS của biofilm tạo nên một nơi trú ẩn và một khu vực ổn định về các điều kiện môi trường thuận lợi cho vi sinh vật tồn tại trong đó. Mạng lưới EPS thể hiện những vai trò khác nhau trong cấu trúc và chức năng của các biofilm

khác nhau. EPS như một lớp bảo vệ có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập của các tác nhân kháng vi sinh vật thông qua hoạt động của các kênh trao đổi anion, các kênh trao đổi anion có vai trò hạn chế sự khuếch tán các chất ở môi trường xung quanh vào trong biofilm đặc biệt đối với các tác nhân kỵ nước và tích điện dương như các aminoglycoside [53]. Các nghiên cứu cũng đã chứng minh mạng lưới EPS của biofilm có khả năng ngăn cản sự thâm nhập quá mức của các ion kim loại, cation và các độc chất, bảo vệ vi sinh vật khỏi các tác nhân stress của môi trường như pH, tia UV, áp suất thẩm thấu và sự mất nước [54, 55].

1.3.2.2. Tăng khả năng sử dụng nguồn dinh dưỡng

Hệ thống kênh vận chuyển nước trong biofilm có vai trò vận chuyển một lượng lớn dinh dưỡng và các sản phẩm quá trình trao đổi chất giữa biofilm với môi trường. Hệ thống này giúp tăng khả năng cung cấp dinh dưỡng cho các tế bào trong biofilm cũng như đào thải các chất độc trong quá trình chuyển hóa dinh dưỡng [56]. Trong biofilm đa chủng có sự cộng sinh lẫn nhau xảy ra giữa các chủng vi sinh vật, các chủng vi sinh vật sẽ hỗ trợ lẫn nhau trong quá trình chuyển hóa các vật chất dinh dưỡng giúp tăng cường hiệu quả sử dụng nguồn dinh dưỡng trong môi trường. Nghiên cứu của Decho [56] và Flemming [57] đã chứng minh trong cấu trúc biofilm đa chủng vi sinh vật thì mỗi chủng đóng vai trò khác nhau trong chuỗi thức ăn. Sự phân hủy các hợp chất hữu cơ hỗn hợp để tạo thành methane và carbon dioxide trong điều kiện kỵ khí cần ít nhất 3 chủng vi khuẩn khác nhau; trong đó các chủng vi khuẩn lên men để tạo thành các acid và rượu, đây lại là cơ chất cho các vi khuẩn lên men tạo acetate. Acetate từ đó được các chủng vi khuẩn khác sử dụng để phân hủy tạo thành methane và carbon dioxide.

Trong tự nhiên các biofilm đa chủng rất phổ biến cũng chính nhờ sự cộng sinh giữa các chủng vi sinh vật tồn tại trong đó tạo nên một chuỗi thức ăn liên tục, mỗi chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng các nguồn cơ chất khác nhau từ đó tạo cho biofilm có tiềm năng sử dụng nhiều nguồn cơ chất khác nhau cũng như khả năng sử dụng một cách triệt để nguồn dinh dưỡng.

1.3.3. Ứng dụng của biofilm trong xử lý ô nhiễm dầu

1.3.3.1. Ứng dụng của biofilm trong xử lý ô nhiễm dầu trên thế giới

Hiện nay, vấn đề phòng chống ô nhiễm môi trường do dầu gây ra đang là mối quan tâm hàng đầu của nhiều quốc gia, nhất là những nước có nền công nghiệp

dầu khí phát triển. Hàng năm các hoạt động khai thác, vận chuyển, sử dụng và các sự cố rò rỉ, tràn dầu đã làm cho hàng trăm triệu tấn dầu rơi vãi gây ô nhiễm nghiêm trọng môi trường nước. Đã có nhiều nghiên cứu và thực tế ứng dụng chứng minh phương pháp sinh học là phương pháp xử lý nước nhiễm dầu hiệu quả, với chi phí thấp và đảm bảo cân bằng sinh thái. Trong nhóm phương pháp xử lý sinh học thì phương pháp sử dụng màng sinh học (biofilm) đang được nhiều nước trên thế giới quan tâm nghiên cứu, ứng dụng và thu được nhiều kết quả khả quan.

Những phát hiện đầu tiên về biofilm trong phân hủy sinh học các thành phần dầu phải kể đến đó là Teh & Lee [58] đã sử dụng 2 chủng vi khuẩn tạo màng sinh học phân lập trong các kho xăng ở Australia và chứng minh chúng có khả năng phân hủy tốt các thành phần n-alkane từ C13-C18. Cafone và cộng sự cũng nghiên cứu 2 chủng vi khuẩn phân lập từ kho xăng và cũng thấy rằng chúng có khả năng sinh trưởng tối ưu với nguồn carbon là C11. Một số, chủng nấm mốc phân lập cũng từ kho xăng cũng cho thấy khả năng phân hủy tốt các hợp chất hydrocarbon từ C12-C24. Đặc biệt, các chủng thuộc loài Hormoconis resinae và Aspergillus fumigatus phân lập từ các mẫu ô nhiễm dầu diesel cũng chứng minh khả năng sinh trưởng tốt trên nguồn cơ chất này. Nghiên cứu của Prince & Morton [59] cho rằng, tại lớp bề mặt tương tác giữa dầu và nước sẽ tạo ra lớp màng sinh học của các vi sinh vật. Lớp màng này có khả năng phân cắt dầu thành các hạt nhỏ hơn, nhờ đó chúng có thể dễ dàng phân hủy và chuyển hóa các thành phần dầu mỏ. Các nhóm vi sinh vật này thường là Hormoconis resinae,

Cladosporium vesinae, Amorphotheca resinae, … Các chủng này có khả năng sử

dụng các loại nhiên liệu như xăng máy bay, dầu diesel,… rất tốt. Do đó, chúng đã được ứng dụng trong xử lý nước ô nhiễm dầu. Tiếp đó càng ngày càng có nhiều nghiên cứu, công nghệ, hệ thống ứng dụng hiệu quả biofilm trong xử lý ô nhiễm dầu mỏ.

Trong xử lý nước thải nhiễm dầu, biofilm được ứng dụng dựa trên hai kỹ thuật cơ bản đó là: biofilm tầng tĩnh (Fixed bed biofilm reactor) và biofilm chuyển động (Moving bed biofilm reactor-MBBR).

Kỹ thuật biofilm tầng tĩnh sử dụng các tấm bùn được cố định trong bể phản ứng, thành phần chính của tấm bùn là hệ thống các biofilm được cố định trên vật liệu mang. Khi nước thải được bơm vào bể phản ứng, nước thải sẽ đi qua và tiếp xúc các tấm bùn, tại đây các chất hữu cơ sẽ được vi sinh vật phân giải. Các công nghệ được phát triển

trên kỹ thuật này bao gồm như: hệ thống lọc ngang (Horizontal flow filter), hệ thống lọc ngược dòng (Upflow filter), hệ thống lọc xuôi dòng (Downflow filter) và hệ thống xử lý đĩa quay sinh học (Rotating biological Contactors- RBCs). Các công nghệ này chỉ khác nhau về cách đưa dòng chảy tiếp xúc với tấm bùn.

Hình 1.3. Các hệ thống lọc biofilm tầng tĩnh

(http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/srb/index_11.htm)

Hình 1.4. Hệ thống đĩa quay sinh học RBC [60]

Biofilm tầng tĩnh được ứng dụng rất phổ biến trong xử lý nước thải nhiễm dầu bởi sự đơn giản trong vận hành hệ thống cũng như đem lại hiệu quả trong quá trình xử lý. Kỹ thuật biofilm tầng tĩnh thường sử dụng các vật liệu mang đơn giản, rẻ tiền có những đặc điểm phù hợp (diện tích bề mặt lớn, bề mặt gồ ghề, …) cho sự tạo biofilm của vi sinh vật như sỏi nhẹ, xốp mút, sơ dừa và một số vật liệu polymer [61].

Trên thực tế ở các hệ thống xử lý sinh học để tăng hiệu quả xử lý thì việc sục khí để bổ sung oxygen tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động là cần thiết. Hơn nữa quá trình phân hủy hiếu khí các thành phần dầu diễn ra trong thời gian ngắn hơn rất nhiều so với phân hủy kỵ khí, nên trong công nghệ biofilm nói chung việc ưu tiên sử dụng các chủng vi sinh vật hiếu khí được triển khai ở hầu hết các hệ thống xử lý [62]. Trong kỹ thuật biofilm tầng tĩnh tùy thuộc vào chủng vi sinh vật sử dụng mà các tấm bùn được cung cấp không khí trong quá trình xử lý hoặc không. Một số công nghệ sử dụng tấm bùn kỵ khí như upflow anaerobic sludge blanket (UASB), công nghệ sử dụng tấm bùn có cung cấp không khí như biological aerated filter (BAF). Các hệ thống

được đề xuất trong xử lý nước thải nhiễm dầu cũng khá đa dạng, trong đó có sự kết hợp giữa việc sử dụng hệ thống màng (các tấm bùn) với xử lý bằng vi sinh vật ở dạng bùn hoạt tính hay dạng tế bào tự do; hoặc kết hợp giữa UASB với BAF. Tong và cs [63] đề xuất một hệ thống xử lý nước thải nhiễm dầu áp dụng kỹ thuật biofilm tầng tĩnh kết hợp với sử dụng bùn hoạt tính đem lại khả năng xử lý 64% COD sau 18h, hệ thống đem lại hiệu quả xử lý tốt các thành phần n- alkanes (C15 – C23). Zou [64] sử dụng hệ thống bao gồm 01 hệ thống các tấm bùn kỵ khí ngược dòng (Upflow anaerobic sluge blanket – UASB) và 02 hệ thống tấm bùn hiếu khí (Biological aerated filter - BAF) cho hiệu quả xử lý 90,2% ammonia nitrogen, 90,8% dầu tổng số và 86,5% PAH.

Hình 1.5. Hệ thống xử lý nước thải nhiễm dầu áp dụng kỹ thuật biofilm tầng tĩnh [63]

(1-Đường cấp nước thải; 2-Bể điều hòa; 3-Van điều chỉnh; 4-Máy bơm; 5-Van cấp dinh dưỡng; 6-Bể xử lý bằng bùn hoạt tính; 7-Bể lắng; 8-Bể xử lý bằng màng sinh học; 9-Hệ thống tấm bùn; 10-Đầu nước thải ra; 11-Bơm sục khí; 12-Van xả bùn)

Trong công nghệ biofilm một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả xử lý đó chính là khả năng khuếch tán của các vật chất ô nhiễm trong nước thải vào hệ thống màng sinh học, ở các kỹ thuật lọc ngang, lọc ngược dòng và lọc xuôi nước thải được tiếp xúc với tấm bùn theo một chiều nhất định nên sự khuếch tán của chất ô nhiễm diễn ra theo chiều chuyển động của dòng chảy. Để tăng hiệu quả xử lý của biofilm tầng tĩnh, công nghệ đĩa quay sinh học (RBCs) được nghiên cứu và ứng dụng. Trong công nghệ RBCs các tấm bùn được gắn trên một rotor quay giúp tăng khả năng khuếch tán chất ô nhiễm vào hệ thống màng sinh học cũng như tạo điều kiện cho vi sinh vật hiếu khí hoạt động, từ đó tăng hiệu quả và thời gian xử lý ô nhiễm. Hệ thống đĩa quay sinh học RBC sử dụng biofilm đơn chủng Pseudomonas alkanolytica ATCC 21034 được ứng dụng trong xử lý các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễm dầu, kết quả xử lý đạt 87,9% lượng dầu tổng số với 4 hệ thống đĩa quay, hiệu suất xử lý đạt cao nhất ở nồng độ dầu tổng số trong nước thải là 2% v/v [60].

Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng mặc dù cùng sử dụng tác nhân vi sinh vật trong xử lý nhưng công nghệ biofilm đem lại hiệu quả xử lý cao hơn hẳn so với các phương pháp sinh học hiện tại đang ứng dụng. Biofilm chủng nấm men Candida tropicalis trên vật liệu mang sỏi có khả năng phân hủy nhanh và hiệu quả các thành

phần của dầu diesel, hiệu quả xử lý đạt 98% sau 10 ngày cao hơn hẳn so với nấm men ở dạng tự do hiệu quả xử lý chỉ đạt 80% ở cùng thời gian xử lý [65]. Tác giả Chavan & Mukherji [66] đã sử dụng biofilm đơn chủng vi khuẩn Burkholderia

.4 Hệ thống đĩa quay sinh học RBC

Vật liệu mang vi sinh