- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất.
- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất.
- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ
2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu đƣợc
- Xác định nhiệt độ nóng chảy. - Đo phổ IR, phổ UV, phổ khối.
2.3 Phƣơng pháp thực nghiệm 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn
- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C.
- Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2o
2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp khuếch tán
- Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm
định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
- Tiến hành:
+ Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 16-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106-108 tế bào/ml.
+ Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa.
+ Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:
Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 50oC, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định.
Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định.
Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV kiểm định. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng.
+ Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.
+ Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:
2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n Trong đó:
D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn
i
D (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh
n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n=3)
2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên
- Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 166.28, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1
(định ước). Sau đó, pha loãng tương tự đến nồng độ 10-6 bằng nước vô trùng.
- Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT2 trong đĩa Petri. Dùng que trang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho các đĩa vào tủ ấm 28°C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.
- Phép chọn lọc tự nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển đặc thù, mọc riêng rẽ sau 6 ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
2.3.4 Đột biến bằng ánh sáng UV
- Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 166.28, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1
pha loãng đến nồng độ 10-6
làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa Petri vô trùng.
- Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1 đựng trong đĩa Petri được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách và thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian 5 phút), sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5
bằng nước vô trùng.
- Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng 10-6 và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-4 và 10-5 vào các đĩa Petri có chứa MT2, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song. Các đĩa Petri sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức: % độ sống sót = m o N N x 10 -6+k x 100% Trong đó: Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến
No: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
10-k : Nồng độ hỗn dịc bào tử được sử dụng.
- Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên. Làm song song mẫu chứng. Phần trăm biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:
% biến đổi hoạt tính = i 100%
o
D
D
Trong đó:
i
D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến
o
D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
- Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.5 Phƣơng pháp đột biến hoá học
- Mục đích: Tạo ra những chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao hơn.
- Tiến hành:
+ Tạo hỗn dịch bào tử: chuẩn bị các ống nghiệm vô trùng. Sau đó lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 166.28 vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất với độ pha loãng 10-1 định ước.
Mẫu chứng: lấy 1,0ml này pha tiếp thành các nồng độ 10-2 – 10-6.
Mẫu đột biến: cho 0,07g NaNO2 vào 9ml còn lại của nồng độ 10-1. Sau đó, nhỏ vài giọt dung dịch HCl 1N vào ống nghiệm trên sao cho pH đạt 4,5. Để yên 2 – 3 phút. Nhỏ dung dịch NaOH 1N đến pH 7 – 8. Sau đó pha loãng thành các nồng độ 10-2 – 10-5
.
+ Các bước cấy hỗn dịch bào tử, xác định tỷ lệ sống sót sau đột biến, chọn lọc ngẫu nhiên các chủng đem nuôi cấy và xác định hoạt tính kháng sinh được tiến hành tương tự như phương pháp đột biến UV.
2.3.6 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh
- Nguyên tắc: Sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy bề mặt
tối ưu cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các môi trường lỏng tương ứng.
- Tiến hành
+ Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 166.28 sau khi nuôi cấy trên
thạch nghiêng (MT2) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2dt bằng 10ml nước vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
+ Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MT khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất. Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml
chứa các MT dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10. Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h. Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT2dt được lên men trên môi trường tối thích cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất.
2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ
- Mục đích: Xác định dung môi và pH chiết tối ưu cho dịch lọc. - Tiến hành: Dùng phương pháp chiết 1 lần.
+ Dịch lọc được chỉnh về các pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M.
+ Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với nhiều dung môi khác nhau: Dịch lọc và dung môi cho vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi:Vdịch lọc = 1:5. Sau đó lắc kỹ trong 1 phút. Để yên 1h cho phân lớp. Tách riêng lấy lớp dung môi và dịch lọc.
+ Sau mỗi lần chiết, lấy lớp dung môi và lớp dịch lọc thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp khoanh giấy.
2.3.8 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng
- Mục đích: Xác định các thành phần kháng sinh trong dịch lọc hoặc xác định
kháng sinh đã tinh khiết hay chưa.
- Tiến hành:
+ Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110°C/30 phút.
+ Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để yên bình khoảng 1h để bão hòa dung môi.
+ Dùng ống mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc ký lên bản mỏng. Chấm nhiều lần, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 50°C.
+ Đặt bản mỏng vào bình sắc ký. Cho dung môi chạy lên khoảng ¾ chiều dài bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy.
+ Xác định vết theo các phương pháp sau:
Soi đèn tử ngoại: Đặt bản mỏng sắc ký vào đèn tử ngoại, vết chất thử sẽ hiện màu.
Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ một lớp vừa phải MT thạch thường đã cấy VSV kiểm định sao cho bản mỏng chìm trong thạch. Để vào tủ 37°C, ủ trong 18-24h, vòng vô khuẩn xuất hiện nếu có kháng sinh.
Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 70°C trong 10’ để phát hiện vết. Dùng thuốc thử ninhydrin 1% trong cồn để phát hiện các kháng sinh có chứa nhóm amin. + Tính hệ số Rf (Retardation factor) f a R b
Trong đó: a: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết họat chất b: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi.
2.3.9 Thu kháng sinh thô bằng phƣơng pháp cất quay
Pha dung môi hữu cơ thu được sau khi chiết được cất quay bằng máy cất chân không. Nhiệt độ cất từ 60°C, p= 0,9 atm. Cắn thu được được hòa tan bằng một lượng nhỏ methanol, đổ vào bình nón sạch, bốc hơi ở 50°C đến khô. Thu lấy bột kháng sinh thô.
2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột
- Pha hệ dung môi chạy theo đúng tỷ lệ.
- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột có đường kính 1cm, dài 50cm được rửa sạch, tráng cồn, sấy khô. Cân khoảng 8g hạt Silicagel nhồi cột, hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy và đưa lên cột.
- Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol rồi trộn với khoảng 2g Silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 50°C cho bay hết methanol rồi cho lên cột, ổn định cột trong 30 phút.
- Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch, khoảng 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml.
- Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa kháng sinh cần tách: Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Các phân đoạn chính là các phân đoạn từ khi xuất hiện vết đến khi không còn vết có Rf tương đương và vẫn có hoạt tính kháng sinh mạnh.
- Các phân đoạn chính sau khi chạy cột được gộp vào bình cầu , cất quay trên không ở 60°C đến khô. Cạo thu bột tinh thể kháng sinh vào ống nghiệm sạch. Sau đó, bột tinh thể kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi, lọc, sấy khô ở 50°C để thu kháng sinh tinh khiết.
2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu đƣợc
Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, tử ngoại, phổ khối để bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được.
CHƢƠNG III : KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHÂN XÉT
3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên
Mục đích : Chọn dạng chủng có hoạt tính kháng sinh cao trong quẩn thể .
Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 166.28, nuôi cấy trên MT2. Sau 6 ngày thực hiện đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch . Kết quả chính được trình bày ở bảng 4
Bảng 3.1 : Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên.
Dạng chủng Hoạt tính kháng sinh Dạng chủng Hoạt tính kháng sinh
S.flexneri B.cereus S.flexneri B.cereus
D (mm) s D (mm) s D (mm) s D (mm) s SLNN.1 21,13 0,93 21,45 0,36 SLNN.15 22,98 1,62 22,45 0,79 SLNN.2 19,61 0,58 20,05 0,42 SLNN.16 17,64 0,21 18,18 0,91 SLNN.3 23,89 0,50 22,91 0,36 SLNN.17 20,86 2,28 20,22 1,13 SLNN.4 19,89 0,77 19,68 0,22 SLNN.18 20,42 0,69 21,71 1,55 SLNN.5 21,83 0,84 20,64 1,16 SLNN.19 19,11 1,69 20,88 2,06 SLNN.6 21,59 0,41 21,31 1,07 SLNN.20 21,50 0,47 21,05 1,08 SLNN.7 22,66 0,74 22,49 0,32 SLNN.21 20,01 0,42 20,89 1,63 SLNN.8 21,97 0,41 21,01 0,77 SLNN.22 19,15 1,32 18,85 0,64 SLNN.9 19,97 1,60 21,14 1,42 SLNN.23 19,05 1,38 19,55 1,42 SLNN.10 21,57 0,79 21,06 0,43 SLNN.24 21,75 1,02 21,76 0,98 SLNN.11 20,91 0,87 20,59 1,06 SLNN.25 20,09 1,41 20,18 1,28 SLNN.12 22,47 2,45 21,37 0,73 SLNN.26 19,02 0,78 19,89 2,31 SLNN.13 20,78 1,08 20,45 0,13 SLNN.27 19,71 1,52 19,99 1,58 SLNN.14 18,93 1,66 18,41 0,55 SLNN.28 18,44 0,52 18,87 1,99
Nhân xét : Sau SLNN , các chủng có hoạt tính tốt nhất là SLNN.3 ; SLNN.7 ;
3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1.
Mục đích : Tạo biến chủng có khả năng sinh tổng hợp KS tăng mạnh
Đem đột biến chủng SLNN.3 đột biến bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách chiếu 60 cm, thời gian 5 phút. Kết quả chính đánh giá HTKS của các biến chủng được trình bày ở bảng 5.
Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính KS đột biến lần 1
Dạng chủng Hoạt tính kháng sinh S.flexneri B.cereus D (mm) s % biến đổi hoạt tính D (mm) s % biến đổi hoạt tính ĐB1.1 20,41 0,58 111,03 23,07 0,33 118,87 ĐB1.2 22,23 0,48 120,96 22,31 1,42 114,92 ĐB1.3 19,41 0,34 105,62 22,55 0,11 116,19 ĐB1.4 23,27 1,11 126,62 21,99 1,54 113,31 ĐB1.5 19,73 0,53 107,33 20,48 0,39 105,51 ĐB1.6 21,34 1,05 116,10 20,93 0,23 107,85 ĐB1.7 20,35 0,06 110,72 21,22 0,92 109,33 ĐB1.8 22,37 0,72 121,69 22,62 0,47 116,54 ĐB1.10 20,80 0,07 113,17 20,69 0,27 106,58 ĐB1.11 22,31 0,25 121,40 23,11 0,09 119,08 ĐB1.13 20,70 0,85 112,62 22,14 0,99 114,06 ĐB1.14 22,14 0,61 120,46 22,48 1,21 115,82 ĐB1.16 20,97 0,31 114,07 22,70 0,53 116,95 ĐB1.17 21,62 0,43 117,63 21,49 0,55 110,70 ĐB1.18 22,62 0,50 123,07 22,34 1,05 115,10 ĐB1.19 20,87 0,72 113,57 21,65 0,81 111,52 ĐB1.20 22,93 0,65 124,74 23,18 1,14 119,42 ĐB1.21 19,71 0,13 107,22 20,35 0,23 104,83 ĐB1.22 22,65 0,62 123,21 23,05 0,34 118,77 ĐB1.24 23,73 0,28 129,09 24,47 0,45 126,05 MC 18,38 0,46 100,00 19,41 0,15 100,00
Nhân xét: 3 biến chủng ĐB1.4 ; ĐB1.20 ; ĐB1.24 cho HTKS mạnh nhất , được giữ lại sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2.
Mục đích : tạo biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tăng mạnh
Tiếp tục đem chủng ĐB1.24 đột biến bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng