Tình hình thế giới - (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu- 123docz.net

a) Công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 trên cây lúa

Vấn đề quan tâm lớn nhất của công nghệ CRISPR/Cas là khả năng di truyền của các gen đột biến và sự có mặt của các gen chuyển trong cây. Nhiều báo cáo đã chứng minh rằng các đột biến một hay nhiều điểm đều có thể di truyền một cách ổn định ở các thế hệ (Yan et al., 2016; Wang et al., 2014; Ji et al. 2015; Pan et al. 2016). Pan và cộng sự (2016)[20], [17] đã chứng minh tính di truyền của các đột biến gen PDS ở loài Solanum lycopersicum. Tương tự, Fauser và cộng sự (2014) cũng chứng minh CRISPR/Cas tạo ra các dòng cà chua đột biến di truyền qua các thế hệ T0, T1 và T2. Liang và cộng sự (2017) đã tạo ra 5 dòng lúa mì đột biến không mang gen ngoại lai từ 100 phôi non bằng công cụ CRISPR/Cas9 RNPs [17].

Phương pháp chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã được áp dụng ở gần 20 loài cây trồng cho đến nay (Ricroch et al., 2017) [19], trong đó cây lúa đã và đang được quan tâm với mục đích cải thiện các đặc tính nông sinh học liên quan đến năng suất, khả năng chống chịu stress sinh học và phi sinh học [19].

Cải thiện năng suất và chất lượng

Zhou và cộng sự (2016) [16] ứng dụng kỹ thuật CRISPR/Cas9 tạo ra các đột biến đặc hiệu gen TMS5 để tạo ra 11 dòng lúa indica TGMS mới. Trong một thí nghiệm tương tự, công nghệ CRISPR/Cas9 đã được sử dụng để huớng đến gen mục tiêu Carbon Starved Anther (CSA) giúp cây có khả năng thụ phấn trong điều kiện ngày ngắn và ngày dài ở lúa japonica để phát triển lúa lai hai dòng PGMS 9522csa

và JY5Bcsa và một dòng rP(T)GMS145 (Li và cs., 2016) [20]. Các kết quả trên cho thấy, CRISPR/Cas9 có tiềm năng ứng dụng để tạo các dòng TGMS trong nhân giống lúa lai hai dòng [20].

Sự hư hỏng hạt trong quá trình bảo quản làm giảm chất lượng và khả năng nảy mầm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Khả năng lưu trữ hạt giống lúa bị chi phối chủ yếu bởi các enzyme lipoxygenase (LOX) xúc tác quá trình khử oxy của axit béo để tạo thành hydroperoxit. Ba trong số 14 protein LOX (LOX1, LOX2 và LOX3) có chức năng riêng biệt trong cây lúa có tác động bất lợi đến thời gian bảo quản hạt giống. Ma và cộng sự (2015) [23] ứng dụng công nghệ TALEN để tạo đột biến hiệu quả cho gen LOX3 sử dụng một cặp monome. Kết quả cho thấy hạt của các dòng đột biến có khả năng lưu trữ được cải thiện [23].

Cải thiện khả năng chống chịu stress sinh học

Wang và cộng sự (2016) [18] đã sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 SSN để chỉnh sửa gen mục tiêu sERF922 tại một và nhiều vị trí. Trong số 21 dòng đột biến được tạo ra tất cả đều mang các allele đột biến tăng khả năng kháng bệnh và di truyền sang các thế hệ T0, T1 và T2 [18].

Cải thiện kháng stress phi sinh học

Gần đây, đột biến dựa trên chỉnh sửa bộ gen đã được ứng dụng để tạo ra các giống lúa chịu thuốc diệt cỏ (Li và cs, 2016; Sun và cs, 2016) [20]. Theo Li và cộng sự (2016) đã thay thế gen bằng kỹ thuật TALEN dựa trên tái tổ hợp tương đồng (HR) trên cây lúa và tạo ra đột biến điểm kép gen OsALS tăng khả năng chống chịu thuốc diệt cỏ. Hiệu suất đột biến là 6,3% và ổn định cho khả năng chịu thuốc diệt cỏ mạnh. Trong một thí nghiệm tương tự, HR qua trung gian CRISPR/Cas9 đã được thực hiện để tạo nhiều đột biến điểm riêng lẻ trong gen ALS ở lúa (Sun và cs, 2016) [20]. Sàng lọc kiểu hình cho thấy cây dại mọc sau 36 ngày phun bispyribac natri (BS) trong khi các dòng đột biến chỉnh sửa gen có khả năng chịu đựng với BS và sinh trưởng bình thường. Do đó, công nghệ chỉnh sửa bộ gen có thể là công cụ hiệu quả để tạo ra cây lúa kháng thuốc diệt cỏ đồng hợp tử [20].

Cây lúa nhạy cảm với nhiệt độ thấp, đặc biệt là ở giai đoạn cây con. Do đó, cải thiện khả năng chịu lạnh có thể tăng cường đáng kể năng suất lúa. TIFY1b, một yếu tố phiên mã, là một trong những yếu tố chịu lạnh liên quan đến gen được phát hiện trên cây lúa. Công nghệ CRISPR/Cas9 đã được sử dụng để chỉnh sửa TIFY1b và gen tương đồng TIFY1a (Huang và cs, 2017) [21]. Các đột biến điểm đăc hiệu đã được quan sát thấy ở cây lúa T0. Nghiên cứu chỉ ra rằng các dòng đột biến TIFY1 có thể được tiếp tục sử dụng để nghiên cứu vai trò của gen TIFY1 trong sự thích nghi của cây lúa với nhiệt độ thấp [21].

Cải thiện dinh dưỡng cây trồng

Chỉnh sửa bộ gen cũng có thể được sử dụng để sửa đổi gen lúa dẫn đến các giống không độc hại và lành mạnh hơn. Cadmium (Cd) là một kim loại nặng có độc tính cao, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe ở những người tiêu thụ gạo như một loại lương thực chính. Hàm lượng Cd trong các giống indica tương đối nhiều hơn so với các giống lúa japonica và cần được kiểm soát về an toàn thực phẩm (Arao và Ishikawa, 2006; Grant và cs, 2008) [21]. Một số biện pháp như xử lý đất, xử lý ô nhiễm, ngập đồng ruộng và sử dụng than đã được thực hiện để giảm mức Cd nhưng chúng chỉ có hiệu quả ở một mức độ nào đó. Các cách tiếp cận thông thường để phát triển các giống lúa Cd thấp là một thách thức rất lớn và các chiến lược mới cho các dòng lúa hấp thu ít Cd là bắt buộc đối với sức khỏe cộng đồng. Hệ thống chỉnh sửa CRISPR/Cas9 gần đây đã được sử dụng để phát triển các dòng lúa indica với mức tích lũy Cd thấp bằng cách loại bỏ gen vận chuyển kim loại OsNramp5 (Tang và cs, 2017) [22]. Thử nghiệm thực địa các dòng lúa indica đột biến cho thấy nồng độ Cd trong hạt OsNramp5 luôn thấp [22].

hơn 0,05 mg/kg, so với nồng độ Cd cao từ 0,33 đến 2,90 mg/kg trong hạt gạo indica loại hoang dại mà không ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Hệ thống chỉnh sửa bộ gen dự kiến sẽ được sử dụng trong tương lai gần để giảm thiểu nhiều rủi ro ô nhiễm kim loại nặng trong hạt gạo [22].

Một trong những công trình nghiên cứu đánh dấu bước tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử dụng A. tumefaciens là công trình của Hiei et al. (1994) [11]. Nhóm nghiên cứu này đã xây dựng được quy trình chuyển gen hiệu quả cho một số giống lúa nhóm Japonica như Tsukinohikari, Asanohikari và Koshihikari. Từ đó, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi và cải tiến ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [11].

Hiện nay, trên thế giới việc xác định chức năng gen ở cây lúa rất được chú trọng và giữ một vai trò quan trọng trong nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng dụng. Bằng phương pháp nghiên cứu chức năng gen có thể khám phá ra được các gen kiểm soát những đặc điểm nông sinh học quan trọng như năng suất, chất lượng hạt, tính chống chịu stress sinh học và phi sinh học, hiệu quả sử dụng dinh dưỡng. Thành công trong kỹ thuật chuyển gen lúa mở đường cho việc nghiên cứu chức năng gen theo các hướng: gây bất hoạt gen, gây siêu biểu hiện gen và đánh giá mức độ hoạt động của promoter thông qua biểu hiện của gen chỉ thị [11].

Vì vậy chọn giống lúa đột biến được bắt đầu từ những năm 1960 và cho đến năm 2006 đã có rất nhiều giống lúa đột biến được đưa ra sản xuất trên thế giới. Năm 1966, Nhật Bản đã đưa ra sản xuất giống lúa Remei - là một giống đột biến của từ giống lúa địa phương chịu lạnh Fujiminori - có đặc điểm thấp cây, chống đổ, được ưa chuộng và thường được sử dụng trong việc lai tạo với các giống lúa khác. Hiện nay đã có hơn 60 giống lai tạo từ giống Remei được trồng ở Nhật Bản và đặc biệt là giống lúa Ikuhikari được tạo ra bằng cách lai giữa Remei và giống lúa đặc sản Koshihikari để đưa gen chống đổ sd1 vào giống lúa Koshihikari. Giống lúa đột biến từ giống Pandawangi là một giống lúa địa phương nổi tiếng về hương thơm, vị ngon và có thêm đặc tính kháng bệnh rầy nâu BHP type 1. Một trong những công trình nghiên cứu đánh dấu bước tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử dụng A. tumefaciens là công trình của Hiei et al. (1994) [11]. Từ đó, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi và cải tiến ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới [11].

Tại Ấn Độ, ba giống lúa chất lượng là Basmati 370, Pusa Basmati 1 và Pakistan Basmati được sử dụng làm vật liệu cho chọn giống đột biến. Các giống này

được xử lý chiếu xạ bằng tia gamma với liều chiếu 100, 150 và 200 Gray. Qua thế hệ M7 đã chọn lọc được 15 dòng đột biến từ giống Basmati 370, 07 dòng đột biến từ giống Pusa Basmati 1 và 10 dòng đột biến từ giống lúa Pakistan Basmati. Trong số các dòng đột biến nhận được, thấy xuất hiện một dòng đột biến triển vọng là CR2007, có nguồn gốc từ Basmati 370. Dòng CR2007 có chất lượng tương tự như giống Basmati gốc, nhưng có năng suất vượt trội so với giống gốc và còn có đặc tính kháng đạo ôn cổ bông, bệnh đốm nâu [11].

Phần 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

Giống lúa: Giống lúa J02 và giống lúa thuần Bắc Thơm số 7 Vi khuẩn : chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen ở cây lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

Thiết bị sử dụng và dụng cụ nghiên cứu

Bảng 3.1. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Thiết bị Dụng cụ

Cân phân tích Pank Máy khuấy từ Đèn cồn

Máy đo PH Cốc đong, ống đong Lò vi sóng Đĩa (hạt đậu, peptri) Nồi hấp vô trùng Bình tam giác Tủ sấy Màng bọc Hệ thống giàn đèn Chun nịt Máy cất nước Túi nilon Box cấy vô trùng Giấy thấm

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của Phòng Thí nghiệm Khoa CNSH&CNTP.

3.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chủng khuẩn vi Agrobacterium đến hiệu quả chuyển gen.

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen.

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen.

Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc đến hiệu quả chuyển gen.

Nội dung 5: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1. Sơ đồ quy trình chuyển gen ở lúa [6]

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

a. Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học thực vật (Khoa CNSH & CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ± 2, độ ẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 16h/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux.

- Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 100 mẫu.

Hạt lúa chín được tách bỏ vỏ trấu, sau đó khử trùng bằng viên khử trùng EFFERVESCENT (không độc hại) nồng độ 5g/200ml nước trong thời gian 20 phút. Tiếp đến, hạt được khử trùng bằng cồn 70% trong thời gian 3 phút. Hạt được tráng sạch với nước cất khử trùng 3-4 lần, sau đó thấm khô bằng giấy thấm trước khi đưa vào nuôi cấy. Hạt được nuôi cấy tạo môi sẹo trên môi trường N6+2mg/l 2,4D ở điều kiện nhiệt độ 25OC, thời gian chiếu sáng 16h/ngày. Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành 100 mẫu.

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn Agrobacterium

Vi khuẩn A. tumefaciens được cất giữ trong glycerol ở -80OC được cấy trải trên đĩa peptri chứa môi trường LB (Yeast Extract Powder 5g/L, pepton hoặc trypton 10g/L, agar 12g/L) nuôi cấy trong 3 ngày ở 28oC. Chuyển vi khuẩn A. tumefaciens từ đĩa nuôi cấy (lấy đầy một loop kim cấy) vào ống falcon 50 mL đã khử trùng có chứa 40 mL môi trường lây nhiễm AAM+AS.

Bốn chủng vi khuẩn A.tumfaciens AGL1, EHA105, GV3101 và LBA4404 được sử dụng để chuyển gen cho giống lúa Bắc Thơm số 7 trong nghiên cứu này. Thí nghiệm được tiến hành như sau: mô sẹo và hạt lúa 5 ngày tuổi sẽ được xử lý với 50 ml các chủng khuẩn A. tumefaciens khác nhau đã được chuẩn bị sẵn trong môi trường AAM trước khi cấy lên môi trường đồng nuôi cấy N6D-AS và nuôi cấy trong 3 ngày. Tiếp đó, chuyển lên môi trường N6D để sàng lọc và kiểm tra hiệu quả chuyển gen. Các chủng khuẩn này cùng mang một cấu trúc vector có chứa gen chọn lọc kháng Glufocinate. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 công thức và 3 lần nhắc lại, 100 mẫu/ lần nhắc lại. Thí nghiệm gồm các công thức như sau:

Công thức 1: Không dùng vi khuẩn (đối chứng) Công thức 2: Chủng vi khuẩn AGL1

Công thức 3: Chủng vi khuẩn EHA105 Công thức 4: Chủng vi khuẩn GV3101 Công thức 5: chủng vi khuẩn LBA4404

Các chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu cấy, số mẫu nhiễm, số mẫu chết, số mẫu sống trên môi trường chọn lọc được theo dõi sau 7, 14 ngày; số mẫu nhuộm GUS.

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen

Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen được tiến hành với hai giống lúa J02, giống Bắc Thơm số 7. Nghiên cứu sử dụng chủng vi khuẩn A. tumefacien EHA105, chủng vi khuẩn được sử dụng rất nhiều trong chuyển gen vào cây lúa trên thế giới.

Mô sẹo và hạt lúa 5 ngày tuổi sẽ được xử lý với 50 ml vi khuẩn EHA105 mang gen chọn lọc đã được chuẩn bị sẵn trong môi trường AAM trước khi cấy lên môi trường đồng nuôi cấy N6D-AS và nuôi cấy trong 3 ngày. Tiếp đó, mẫu chuyển lên trên môi trường N6D-GA để kiểm tra hiệu quả chuyển gen. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn gồm 6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu. Công thức 1: 0 phút (đ/c) Công thức 2: 1 phút Công thức 3: 2 phút Công thức 4: 3 phút Công thức 5: 4 phút Công thức 6: 5 phút

Các chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu cấy, số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu chết trên môi trường chọn lọc được theo dõi sau 7, 14 ngày; số mẫu nhuộm GUS.

3.3.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy

Thời gian đồng nuôi cấy ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả chuyển gen. Xác định được thời gian đồng nuôi cấy thích hợp góp phần làm tăng hiệu quả khi chuyển các gen khác vào cây trồng. Thí nghiệm được tiến hành như sau: hạt gạo và mô sẹo 5 ngày tuổi trên môi trường N6D được ngâm trong dung dịch AAM có chứa vi khuẩn EHA105 trong 3 phút. Sau đó, mẫu lúa được chuyển lên môi trường N6D-AS nuôi cấy với 4 mốc thời gian khác nhau . Sau đó, các mẫu này được chuyển sang môi trường N6D-GA và theo dõi trong 20 ngày. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn

toàn với 4 công thức, 3 lần nhắc lại, 100 mẫu cho mỗi lần nhắc lại. Các công thức được bố trí như sau:

Công thức 1: 0 ngày (đ/c) Công thức 2: 1 ngày Công thức 3: 2 ngày Công thức 4: 3 ngày Công thức 5: 4 ngày Công thức 6: 5 ngày

3.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc

Glufocinate là thuốc trừ cỏ tự nhiên, nó có khả năng tiêu diệt những tế bào thực vật thông thường. Chỉ có những tế bào mang gen kháng lại Glufocinate- ammonium mới có khả năng sống sót trên môi trường có chứa Glufocinate ammonium. Nồng độ chất chọn lọc này ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả chuyển gen. Nồng độ chất chọn lọc quá thấpsẽ thu được nhiều cây sau chuyển gen, tuy nhiên số lượng cây dương tính sẽ thấp và ngược lại, nồng độ chất chọn lọc cao, số