Sử dụng các môi trường Murashige and Skoog, 1962 (MS) có bổ sung 30g/l Sucarose + 5g/l agar, các chất BAP, Kinetin, NAA, GA3 (mg/l) có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm, pH=5,6-5,8.
Môi trường nền = MS + 30g/l Sucarose + 5g/l agar.
Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường (MT) nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm.
Bình tam giác, dung tích 250ml
Thể tích MT nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 75 ml/bình. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong 15 phút.
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu
Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.. 3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 3 bình, mỗi bình 6 mẫu.
Sau khi cấy song đưa mẫu vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 220C – 25oC, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, độ ẩm: 60 – 65% quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu.
3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Các thí nghiệm tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại cytokinin tới khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các công thức là:
- Môi trường nền = Môi trường MS + 30g/l Sucrose + 5g/l agar.
- Môi trường nền được bổ sung BAP, Kinetin với nồng độ khác nhau trong từng công thức thí nghiệm.
- Chồi lan Thạch Hộc Tía có kích thước tương đồng sau khi cấy trên môi trường nền thích hợp sẽ được chuyển sang môi trường bổ sung cytokinin (BAP, Kinetin), sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi, quan sát sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Thí nghiệm gồm các công thức sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0 mg/l BAP CT 2: MT nền + 0,5 mg/l BAP CT 3: MT nền + 1 mg/l BAP CT 4: MT nền +1,5 mg/l BAP CT 5: MT nền + 2 mg/l BAP
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0mg/l Kinetin CT 2: MT nền + 0,5mg/l Kinetin CT 3: MT nền + 1mg/l Kinetin CT 4: MT nền + 1,5mg/l Kinetin CT 5: MT nền + 2mg/l Kinetin
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0mg/l BAP + 0,0mg/l Kinetin CT 2: MT nền + 0,3mg/l BAP + 0,5mg/lKinetin
CT 3: MT nền + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/lKinetin CT 4: MT nền + 0,5mg/l BAP + 0,5mg/lKinetin CT 5: MT nền + 1mg/l BAP + 1mg/lKinetin
3.4.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Thí nghiệm 1, 2, 3 xác định được nồng độ thích hợp nhất của nồng độ BAP, Kinetin và BAP kết hợp với Kinetin bổ sung vào môi trường nuôi cây. Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Auxin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Các thí nghiệm tiến hành như sau:
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 1 + 0,0mg/l NAA CT 2: MT nền 1+ 0,5mg/l NAA
CT 3: MT nền 1 + 1mg/l NAA CT 4: MT nền 1 + 1,5mg/l NAA
CT 5: MT nền 1 + 2mg/l NAA
MT nền 1: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + BAP ( (nồng độ BAP thích hợp nhất ở thí nghiệm 1)
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Các công thức thí nghiệm gồm:
CT 1 (Đ/c): MT nền 2 + 0, 0mg/l NAA CT 2: MT nền 2 + 0,5mg/l NAA
CT 3: MT nền 2 + 1mg/l NAA CT 4: MT nền 2 + 1,5mg/l NAA CT 5: MT nền 2 + 2mg/l NAA
MT nền 2: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + Kinetin (nồng độ Kinetn thích hợp nhất ở thí nghiệm 2)
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với NAA đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 3 + 0,0mg/l NAA CT 2: MT nền 3 + 0,5mg/l NAA CT 3: MT nền 3 + 1mg/l NAA CT 4: MT nền 3 + 1,5mg/l NAA CT 5: MT nền 3 + 2mg/l NAA
MT nền 3: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + BAP và Kinetin (nồng độ BAP + Kinetin thích hợp nhất ở thí nghiệm 3)
3.4.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp Cytokinin và Gibberellin
Đề tài thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của việc sử dụng phối hợp của cytokinin và gibberellin (GA3) đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối. Sử dụng môi trường có nồng độ Cytokinin thích hợp đến khả năng sinh trưởng của cây lan Thạch Hộc Tía in vitro ở thí nghiệm 1, 2, 3 và bổ sung GA3 với các nồng độ khác nhau tùy theo công thức thí nghiệm .
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 1 + 0,0mg/l GA3 CT 2: MT nền 1+ 0,5mg/l GA3 CT 3: MT nền 1 + 1mg/l GA3 CT 4: MT nền 1 + 1,5mg/l GA3 CT 5: MT nền 1 + 2mg/l GA3
MT nền 1: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + BAP ( (nồng độ BAP thích hợp nhất ở thí nghiệm 1)
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với GA3
đếnquá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 2 + 0,0mg/l GA3 CT 2: MT nền 2 + 0,5mg/l GA3 CT 3: MT nền 2 + 1mg/l GA3 CT 4: MT nền 2 + 1,5mg/l GA3 CT 5: MT nền 2 + 2mg/l GA3
MT nền 2: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + Kinetin (nồng độ Kinetn thích hợp nhất ở thí nghiệm 2)
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin (khi sử dụng phối hợp) kết hợp với GA3 đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Các công thức thí nghiệm gồm: CT 1 (Đ/c): MT nền 3 + 0,0mg/l GA3 CT 2: MT nền 3 + 0,5mg/l GA3 CT 3: MT nền 3 + 1mg/l GA3 CT 4: MT nền 3 + 1,5mg/l GA3 CT 5: MT nền 3 + 2mg/l GA3
MT nền 3: MT MS + 30 g/l saccarose + 5 g/l agar + BAP và Kinetin (nồng độ BAP + Kinetin thích hợp nhất ở thí nghiệm 3)
3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu
* Các chỉ tiêu theo dõi được thu thập sau 30 ngày nuôi cấy, bao gồm các chỉ tiêu: Hệ số nhân chồi (lần) =
Tổng chồi thu được Tổng chồi nuôi cấy
Biến động chiều cao trung bình (cm) = Chiều cao đại diện của cụm chồi thu được – Chiều cao ban đầu
Biến động số lá trung bình (lá)= Số lá thu được – Số lá ban đầu
Biến động khối lượng trung bình (cm) = Khối lượng thu được – Khối lượng ban đầu
* Phương pháp theo dõi trong nuôi cấy mô
Khi lấy mẫu ra khỏi bình in vitro, rửa sạch agar và tiến hành đo đếm các chỉ
tiêu theo dõi: chiều cao chồi, số lá, khối lượng mẫu, chất lượng mẫu. - Chiều cao mẫu (cm): đo từ gốc đến vút chồi (chồi đại diện).
- Khối lượng mẫu (g): mỗi công thức trong từng thí nghiệm cân nhanh 10 cây để so sánh.
- Số lượng lá (lá): đếm số lá trên mỗi cây sau khi lấy ra khỏi bình nuôi cấy. - Chất lượng mẫu: quan sát bằng mắt thường và so sánh các mẫu với nhau, đánh giá cây theo tiêu chí:
+++ Chồi tốt: thân mập, lá màu xanh đậm
++ Chồi trung bình: thân bình thường, lá màu xanh non.
* Phương pháp xử lý số liệu
- Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Excel 2010.
- Để xác định được sai khác giữa các công thức thí nghiệm quá trình xử lý số liệu được thực hiện trên máy tính bằng phần mềm SAS 9.1 và giá trị trung bình được so sánh theo phương pháp Duncan với P < 0,05.
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ một số loại Cytokinin quá trình
sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Một trong những ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro so với các
phương pháp nhân giống khác là có hệ số nhân cao. Vì vậy có thể coi đây là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống.
Trong kỹ thuật nhân giống in vitro, các chất điều tiết sinh trưởng có vai trò vô cùng quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của lan Thạch Hộc Tía, vì vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều tiết sinh trưởng có ý nghĩa quan trọng trong quá trình nuôi cấy mô cây lan Thạch Hộc Tía. Trên cơ sở tham khảo các công trình trước đây đã nghiên cứu trên một số đối tượng lan Thạch Hộc khác, chúng tôi chọn môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS bổ sung vitamin, đường, agar và các chất kích thích sinh trưởng với các nồng độ khác nhau để nghiên cứu công thức tốt nhất tới sinh trưởng in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
- Bổ sung BAP, Kinetin với các nồng độ khác nhau trong từng công thức thí nghiệm.
Sau khi gieo hạt thành công, chồi tái sinh được cấy chuyển sang các môi trường nuôi cấy, sau đó đặt trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp. Tiến hành theo dõi, quan sát sự sinh trưởng của chồi.
4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
BAP (6-Benzylaminopurin) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cấy mô nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ. Thí nghiệm được thực hiện nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của lan Thạch Hộc Tía. Kết quả của thí nghiệm sau 30 ngày theo dõi được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình sinh
trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía (sau 30 ngày nuôi cấy)
CT Nồng độ BAP (ml/l) Tổng mẫu nuôi cấy (mẫu) Hệ số nhân chồi (lần) Biến động chiều cao trung bình (cm) Biến động số lá trung bình (lá) Biến động khối lượng trung bình (g) Chất lượng chồi 1(ĐC) 0 54 1,56c 1,97d 3,67e 0,43c + 2 0,5 54 2,37b 2,62b 4,22c 0,66b ++ 3 1 54 3,11a 3,79a 5,56a 0,80a +++ 4 1,5 54 2,26b 2,50bc 4,64b 0,62b ++ 5 2 54 1,56c 2,17cd 3,89d 0,51c + LSD05 0,19 0,34 0,17 0,08 CV (%) 4,54 6,84 2,06 7,16 Ghi chú:
+++ Chồi tốt: thân mập, lá màu xanh đậm.
++ Chồi trung bình: thân bình thường, lá màu xanh non.
+ Chồi kém: thân gầy, lá màu xanh nhạt, vàng hoặc chồi dị dạng.
a, b, c… thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức độ tin cậy P < 0,05 theo phương pháp Duncan
Sau 30 ngày theo dõi, ở chỉ tiêu hệ số nhân chồi với giá trị LSD05 là 0,19, hệ số nhân chồi của các công thức tăng theo nồng độ. Khi tăng nồng độ BAP từ 0 – 1 mg/l tương ứng từ CT1 đến CT3, hệ số nhân chồi tăng từ 1,56 lần lên 3,11 lần , đặc biệt là công thức CT3 ở nồng độ 1 mg/l cho hệ số nhân cao nhất đạt 3,11 lần. Tuy nhiên khi tăng nồng độ từ 1,5 – 2 mg/l hệ số nhân chồi lại giảm từ 2,26 mg/l ở CT4 xuống 1,56 mg/l ở CT5.
Về chỉ tiêu biến động chiều cao trung bình với giá trị LSD05 đạt 0,34, ta nhận thấy khi bổ sung BAP với nồng độ từ 0,5 – 2mg/l chiều cao của mẫu cũng tăng lên cao hơn CT đối chứng. Trong đó, cao nhất là CT3 với biến động chiều cao trung bình là 3,79cm và thấp nhất là CT5 chỉ đạt 2,17cm so với CTĐC (1,97cm) sai khác này không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%.
Về biến động số lá trung bình của mẫu, theo kết quả nghiên cứu ở bảng 4.1 cho thấy: Biến động số lá trung bình ở các CT thí nghiệm đều cao hơn so với CT đối chứng (đạt từ 3,89 – 5,56 lá) ở mức tin cậy 95%. Khi sử dụng nồng độ BAP ở nồng
độ 1mg/l thì biến động số lá trung bình đạt cao nhất 5,56 lá. Khi không sử dụng BAP chỉ đạt 3,67 lá.
Biến động về biến động khối lượng trung bình của CT3 (0,80g) lớn hơn CTĐC và các CT còn lại, Tiếp theo là CT2 và CT4 biến động biến động khối lượng trung bình đạt lần lượt là 0,66g và 0,62g, tuy nhiên 2CT này sai khác không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Thấp nhất là CT5 với biến động khối lượng trung bình chỉ đạt 0,51g so với CTĐC (0,43g) sự sai khác không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%.
Chất lượng chồi ở CT3 đạt tốt, chồi cao, mập lá xanh đậm., CT2 và CT4 đạt chất lượng chồi trung bình, cây thấp hơn và nhỏ hơn, chất lượng chồi thấp nhất là ở CT5 và CTĐC.
Mai Thị Tâm, Vũ Thị Thu Hiền, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Trường Sơn (1999), đã kết luận nồng độ BAP thích hợp nhất cho nhân nhanh giống lan
Dendrobium E.R là MS bổ sung 1mg/l BAP [20]. So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả nghiên cứu của tác giả trên thấy kết quả nghiên cứu của tôi hoàn toàn tương đồng, điều này cho thấy môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP cho kết quả phù hợp nhất đối với khả năng sinh trưởng của lan Thạch Hộc Tía so với các nồng độ ở các công thức khác trong thí nghiệm. Kết quả thu được hệ số nhân chồi là 3,11 lần, biến động chiều cao trung bình mẫu đạt 3,79cm, biến động biến động số lá trung bình và khối lượng đạt lần lượt là 5,56 lá và 0,80g.
Hình 4.1: Mẫu lan Thạch Hộc Tía trên môi trường MS bổ sung BAP sau 30 ngày nuôi cấy.
4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía.
Cũng như BAP, Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong nuôi cấy mô - tế bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ